魏譚軍， 王 毅， 陳曉東

(1. 達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 達(dá)州635000;2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌330004)

復(fù)方西羚解毒丸處方來(lái)源于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十四冊(cè)，由淡竹葉、荊芥穗、牛蒡子(炒)、連翹、金銀花、桔梗、甘草、薄荷、淡豆豉、羚羊角、水牛角濃縮粉、冰片這十二味藥物組成［1］。原部頒標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)方中的任何藥物進(jìn)行定性鑒別或定量測(cè)定，不能有效地保證產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相梯度洗脫法對(duì)淡竹葉中的葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和荊芥穗中的胡薄荷酮進(jìn)行定量測(cè)定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 試藥與儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀;G1322A 脫氣機(jī)、G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311A 四元泵、Chemstation 色譜工作站;G1315B 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器;牡荊苷對(duì)照品(111687-200602，純度100.0%，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h 以上使用)、葒草苷對(duì)照品(111777-201302，純度97.9%，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h 以上使用)、胡薄荷酮對(duì)照品(111706-201205，純度99.8%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;異葒草苷對(duì)照品(4261-42-1，純度98.0%)購(gòu)于成都行標(biāo)生物技術(shù)有限公司;復(fù)方西羚解毒丸(6 g/丸，批號(hào)分別為131017、131019、131021)購(gòu)于山東健民藥業(yè)有限公司;冰醋酸(分析純，廣州化學(xué)試劑二廠(chǎng));甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依利特Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);體積流量1.2 mL/min;以甲醇(A)-0.1%冰醋酸溶液(B)為流動(dòng)相［2］，梯度洗脫 (0 ～9 min，60.0% A;9 ～29 min，60.0%→75.0%A;29 ～48 min，75.0%A);檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm［3-5］(0 ～29 min)、252 nm［6-12］(29 ～48 min)。此系統(tǒng)條件下所測(cè)組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數(shù)按牡荊苷計(jì)不得低于3 000，分離度均大于2。

2.2 樣品制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和胡薄荷酮對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加70%甲醇制成混合對(duì)照品溶液(葒草苷為0.032 8 mg/mL，異葒草苷為0.026 2 mg/mL，牡荊苷為0.020 6 mg/mL，胡薄荷酮為0.037 0 mg/mL)。

2.2.2 供試品溶液的配制 取本品適量，剪碎，取約10.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(300 W，40 kHz)35 min，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照試驗(yàn) 按復(fù)方西羚解毒丸處方比例稱(chēng)取除淡竹葉和荊芥穗的其余藥味各一份，按復(fù)方西羚解毒丸的生產(chǎn)工藝分別制成淡竹葉空白樣品和荊芥穗空白樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成淡竹葉空白溶液和荊芥穗空白溶液。分別精密吸取10 μL 的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、淡竹葉空白溶液和荊芥穗空白溶液，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果在與葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和胡薄荷酮對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性對(duì)照色譜圖中未顯吸收峰，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和胡薄荷酮的液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of orientin，luteolin-6-c-glucoside，vitexin and pulegone

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取稀釋后的上述溶液和混合對(duì)照品溶液各20 μL，注入色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下所述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積Y 與進(jìn)樣量X，得回歸方程，葒草苷為Y=2.249 1 ×106X+768.3，r=0.999 6;異葒草苷、牡荊苷為Y = 2.457 4 × 106X - 698.9，r =0.999 7;胡薄荷酮為Y =1.835 2 ×106X +301.5，r=0.999 2。葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和胡薄荷酮分別在0.032 8 ～0.656 0 μg、0.026 2 ～0.524 0 μg、0.020 6 ～0.412 0 μg、0.037 0 ～0.740 0 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定，記錄葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和胡薄荷酮的峰面積，RSD 分別為0.8% (葒草苷)、0.7%(異葒草苷)、0.9% (牡荊苷)和0.4% (胡薄荷酮)。結(jié)果表明，儀器具有良好精密度。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一批樣品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6 份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算，求得各組分RSD分別為0.7% (葒草苷)、0.5% (異葒草苷)、0.9% (牡荊苷)和0.6% (胡薄荷酮)。結(jié)果表明，本法測(cè)定重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 后，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積值，求得各組分RSD 分別為0.7% (葒草苷)、0.8% (異葒草苷)、0.9%(牡荊苷)和0.7% (胡薄荷酮)。結(jié)果表明，供試品溶液24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的同一批復(fù)方西羚解毒丸(批號(hào)131017;葒草苷為0.163 mg/g，異葒草苷為 0.132 mg/g，牡荊苷為0.104 mg/g，胡薄荷酮為0.185 mg/g)適量，剪碎，取約5.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液25 mL、70%甲醇25 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和胡薄荷酮回收率Tab.1 Results of recovery tests for orientin，luteolin-6-cglucoside，vitexin and pulegone

2.4 樣品測(cè)定 取3 個(gè)批號(hào)的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定本品中葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和胡薄荷酮量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(±s，n=3)Tab.2 Results of content determination of the samples (±s，n=3)

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(±s，n=3)Tab.2 Results of content determination of the samples (±s，n=3)

批 號(hào) 葒草苷/(mg/丸) 異葒草苷/(mg/丸) 牡荊苷/(mg/丸) 胡薄荷酮/(mg/丸)1.11 ±0.01 131019 0.926 ±0.008 0.815 ±0.008 0.656 ±0.005 1.28 ±0.01 131021 0.950 ±0.004 0.834 ±0.007 0.662 ±0.007 131017 0.978 ±0.007 0.792 ±0.005 0.624 ±0.004 1.35 ±0.01

3 討論

3.1 供試品溶液提取方法的選擇 曾考察了超聲(300 W，40 kHz)提取20 min、35 min、50 min 和加熱回流2 h 四種制備方法，結(jié)果超聲提取20 min所得樣品中成分含有量較低，超聲提取35 min、50 min和加熱回流2 h 所得樣品中成分含有量基本一致，考慮到檢驗(yàn)過(guò)程的簡(jiǎn)便性和快捷性，選用超聲提取35 min 作為供試品溶液制備的最佳提取時(shí)間。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取一定質(zhì)量濃度的葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和胡薄荷酮對(duì)照品溶液置紫外分光光度計(jì)下掃描，結(jié)果葒草苷、異葒草苷和牡荊苷在340 nm 有最大吸收，胡薄荷酮在252 nm 有最大吸收，為兼顧4 種成分在同一色譜圖上均有最大吸收，因此選用波長(zhǎng)切換法進(jìn)行檢測(cè)。

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