劉 琴， 宋 珅， 郭 杰， 羅 順， 張 繼，2*

(1. 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070;2. 甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州730070;3. 甘肅萬(wàn)州建順生物科技有限公司，甘肅 蘭州730070)

鎖陽(yáng)又名不老藥，是鎖陽(yáng)科植物Cynomorium songaricum Ruhr 的干燥肉質(zhì)莖。其性甘溫，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便之功能。臨床用于腰膝痿軟，陽(yáng)痿滑精，腸燥便秘等。目前對(duì)鎖陽(yáng)的報(bào)道以多糖類(lèi)物質(zhì)居多，如多糖的提取工藝研究［1］，多糖對(duì)染色體端粒長(zhǎng)度的影響［2］，然而關(guān)于其抗氧化活性檢測(cè)方面鮮有報(bào)道。鎖陽(yáng)主要有有機(jī)酸、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、甾體類(lèi)、揮發(fā)性成分、氨基酸類(lèi)、糖類(lèi)、縮合型鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分［3-4］，其中多糖類(lèi)物質(zhì)的體外清除自由基的作用已有研究［5］，但是關(guān)于細(xì)胞水平的研究鮮有報(bào)道。H2O2是一種常用的細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型［6］。VERO 細(xì)胞株即非洲綠猴腎上皮細(xì)胞，生長(zhǎng)迅速，性狀穩(wěn)定，對(duì)藥物敏感，且最重要的一點(diǎn)是猿猴較接近人類(lèi)，用該細(xì)胞進(jìn)行腎臟疾病方面的研究可以減少免疫學(xué)方面的問(wèn)題［7］。故本研究采用VERO 細(xì)胞建立氧化損傷模型，旨在研究鎖陽(yáng)多糖是否對(duì)VERO 細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 鎖陽(yáng)，產(chǎn)地為甘肅酒泉，60 ℃，24 h烘干，粉碎，過(guò)100 目篩，備用。

非洲綠猴腎上皮(VERO)細(xì)胞購(gòu)自ATCC。DMEM -F12 培養(yǎng)基和新生牛血清(Gibco 公司);青霉素(華北制藥股份有限公司);鏈霉素(大連美羅大藥廠);MTT (Sigma-Aldrich 公司);超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛和乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ROS 活性檢測(cè)試劑盒和Caspase-3 活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 公司);Vi-cell 細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀(Beckman 公司);生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司);倒置顯微鏡 (OLYMPUS 公司);SpectraMax M5 酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器有限公司);UV2450 紫外分光光度計(jì)(上海美析儀器有限公司);熒光分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司);高速低溫離心機(jī)(Beckman 公司);電子天平(天津市天馬儀器廠);超聲細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鎖陽(yáng)多糖的制備 取一定量的粉碎好的鎖陽(yáng)粉末，按照張思巨等［8］的方法分離和純化鎖陽(yáng)多糖，苯酚硫酸法［9］測(cè)得含糖量為89.2%，凝膠阻滯色譜法［10］測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量為48.1 ×104(Mw)，GC-MS 法分析［11］表明，鎖陽(yáng)多糖由Man、Glu 和Gal 3 種單糖組成，摩爾比為5.01 ∶89.17 ∶5.82。

1.3.2 VERO 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將凍存的VERO細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速在37 ℃水浴中融化。根據(jù)凍存密度，接種1 ×106個(gè)于含10%小牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基的75 cm2T-FLASK 培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。

當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌兩次;然后用0.25%的胰酶消化，3 ～5 min 后于倒置顯微鏡下觀察消化程度;大部分細(xì)胞變圓，細(xì)胞間連接疏松，表明消化適度，加入少量含10%小牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)液終止消化;吹打，制成單細(xì)胞懸液。取少量懸液通過(guò)Vi-cell測(cè)試細(xì)胞密度，接種所需的密度于培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)板中進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 H2O2誘導(dǎo)VERO 細(xì)胞氧化損傷模型的建立

參照張生等［12］的實(shí)驗(yàn)方法，將生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的VERO 細(xì)胞按照1 ×104個(gè)/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入濃度梯度為100、200、400、800、1 000 μmol/L 的H2O2，每組4 個(gè)復(fù)孔，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育0.5、1、1.5、2 h，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率接近50%時(shí)的H2O2的濃度作為最佳作用濃度。

1.3.4 鎖陽(yáng)多糖對(duì)正常VERO 細(xì)胞的影響 將生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的VERO 細(xì)胞按照密度為1 ×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分6 組，空白對(duì)照組、鎖陽(yáng)多糖0.062 5、0.125、0.25、0.5 和1 mg/mL 劑量組，在37 ℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，加入MTT液(PBS 液配制，終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，加入異丙醇，吹打至藍(lán)色結(jié)晶物完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm 處吸光度(A)。細(xì)胞存活率(%) =［A570(樣品組)/A570(空白對(duì)照組2)］ × 100%。

1.3.5 鎖陽(yáng)多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)VERO 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 細(xì)胞處理同“1.3.4”項(xiàng)。待細(xì)胞貼壁后加入等體積250、500 和1 000 μg/mL 的鎖陽(yáng)多糖，每組6 復(fù)孔。分別孵育8、12、24 h 后，加入終濃度為800 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)孵育1 h后，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.3.6 乳酸脫氫酶(LDH)漏出量的測(cè)定 細(xì)胞處理同“1.3.5”項(xiàng)。細(xì)胞經(jīng)多糖處理后，H2O2處理1 h，收集上清液，嚴(yán)格按照LDH 試劑盒說(shuō)明測(cè)試LDH 釋放量。440 nm 處測(cè)吸光值。LDH 釋放量用總LDH 活性(培養(yǎng)基中的LDH + 細(xì)胞內(nèi)的LDH)的百分比來(lái)表示，計(jì)算公式:LDH 釋放量(%)=(培養(yǎng)基LDH 活性/總LDH 活性)×100%

1.3.7 熒光光度法檢測(cè)caspase-3 活性 細(xì)胞處理同“1.3.5”項(xiàng)，處理完成后，1 000 ×g，4 ℃離心5 min 收集細(xì)胞，PBS 洗滌1 次。取2 ×106個(gè)細(xì)胞加入100 μL 裂解液，冰浴裂解15 min。4 ℃，16 000 ～20 000 ×g 離心10 ～15 min，將上清轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中。取出10 μL 加入反應(yīng)體系37 ℃溫育，變色以后，于405 nm 測(cè)吸光度，嚴(yán)格根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.8 DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平細(xì)胞處理同“1.3.5”項(xiàng)。細(xì)胞經(jīng)多糖處理后，H2O2處理1 h，收集細(xì)胞，加入終濃度為10 μmol /L的DCFH-DA 的無(wú)血清培養(yǎng)液1 mL，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3 ～5 min 顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，充分除去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。熒光分光光度計(jì)測(cè)定 (激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為521 nm)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.3.9 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 細(xì)胞處理同“1.3.5”項(xiàng)。細(xì)胞經(jīng)多糖處理后，H2O2處理1 h，收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，根據(jù)GSH-Px、SOD 和MDA 試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)VERO 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD 活性和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA 水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)差異顯著性。各組數(shù)據(jù)用(±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對(duì)VERO 細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果如圖1 所示，不同濃度的H2O2分別處理VERO 細(xì)胞0.5、1、1.5、2 h 后，細(xì)胞存活率顯著下降(*P ＜0.05，#P ＜0.01)，有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。根據(jù)IC50規(guī)則，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求的損傷時(shí)間和損傷濃度分別為:100 μmol/L 處理2 h，400 μmol/L 處理1.5 h，800 μmol/L 處理1 h，以此建立VERO 細(xì)胞的氧化損傷模型。在這3 個(gè)時(shí)間，細(xì)胞損傷程度均在50%左右，這樣既能使細(xì)胞受到明顯的損傷，又不至于造成細(xì)胞的過(guò)度凋亡，有利于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的探討。

2.2 鎖陽(yáng)多糖對(duì)正常VERO 細(xì)胞的影響 由表1可以看出，與對(duì)照組相比，鎖陽(yáng)多糖預(yù)處理24 h對(duì)正常的VERO 細(xì)胞的活力沒(méi)有明顯的影響。

2.3 鎖陽(yáng)多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)VERO 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 如圖2 所示，與對(duì)照組相比，H2O2能明顯降低VERO 細(xì)胞的存活率(##P ＜0.01)。與H2O2模型組相比，不同質(zhì)量濃度 (0.25 ～1 mg/mL)的鎖陽(yáng)多糖預(yù)處理12、24 h，能夠明顯改善H2O2引起的VERO 細(xì)胞存活率的降低(＊＊P ＜0.01)，并且有劑量依賴(lài)性。預(yù)處理8 h，其保護(hù)作用不明顯。

圖1 不同濃度H2O2 對(duì)VERO 細(xì)胞增殖的影響(n=6)Fig.1 Effect of different concentrations of H2O2 on proliferation of VERO cells (n=6)

表1 鎖陽(yáng)多糖對(duì)正常VERO 細(xì)胞OD 值的影響(n=6)Tab.1 Effect of polysaccharide from Cynomorium songaricum Rupr on the OD of VERO cells (n=6)

圖2 不同質(zhì)量濃度的鎖陽(yáng)多糖對(duì)H2O2 損傷VERO 細(xì)胞存活率的影響(n=6)Fig.2 Effect of different concentrations of polysaccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced viability of VERO cells (n=6)

2.4 鎖陽(yáng)多糖對(duì)H2O2損傷VERO 細(xì)胞的LDH 漏出量的影響 由圖3 所示，與對(duì)照組相比，H2O2模型組的LDH 漏出量明顯增加(##P ＜0.01)，說(shuō)明H2O2對(duì)VERO 細(xì)胞造成損傷，使得細(xì)胞中的乳酸脫氫酶(LDH)釋放到了細(xì)胞培養(yǎng)液中。與模型組相比，加入鎖陽(yáng)多糖處理后，能明顯降低LDH 漏出量(＊＊P ＜0.01)，并且隨著鎖陽(yáng)多糖質(zhì)量濃度的升高。LDH 漏出量減少，表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性，表明鎖陽(yáng)多糖能夠保護(hù)細(xì)胞免受H2O2的損傷。

圖3 不同質(zhì)量濃度的鎖陽(yáng)多糖對(duì)H2O2 損傷的VERO 細(xì)胞LDH 漏出量的影響(n=6)Fig.3 Effect of different concentrations of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on LDH leakage of VERO cells injured by H2O2 (n=6)

2.5 caspase-3 活性檢測(cè)VERO 細(xì)胞凋亡 如圖4所示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞經(jīng)800 μmol/L H2O2處理1 h 后，caspase-3 活性明顯升高(#P ＜0.01)，表明H2O2誘導(dǎo)VERO 細(xì)胞發(fā)生了凋亡，而鎖陽(yáng)多糖自身對(duì)caspase-3 的活性沒(méi)有影響。與模型組相比，在用H2O2誘導(dǎo)損傷之前，細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度(0.5、1 mg/mL)鎖陽(yáng)多糖預(yù)處理后，caspase-3 活性劑量依賴(lài)性的降低(＊＊P ＜0.01)，表明鎖陽(yáng)多糖能夠保護(hù)細(xì)胞免于H2O2損傷，間接抑制細(xì)胞凋亡。

2.6 鎖陽(yáng)多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)VERO 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平影響 如圖5 所示，與對(duì)照組相比，H2O2模型組的ROS 水平明顯升高(##P ＜0.01)，表明H2O2能誘導(dǎo)VERO 細(xì)胞產(chǎn)生ROS，而與模型組相比，不同質(zhì)量濃度的鎖陽(yáng)多糖能夠明顯降低ROS 水平(＊＊P ＜0.01)，并且隨著鎖陽(yáng)多糖質(zhì)量濃度的增加，ROS 水平降低越明顯，表明鎖陽(yáng)多糖能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)VERO 細(xì)胞產(chǎn)生活性氧。

圖4 鎖陽(yáng)多糖對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的VERO 細(xì)胞的caspase-3 活性的影響(n=6)Fig.4 Effect of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced activation of caspase-3 of VERO cells (n=6)

圖5 不同質(zhì)量濃度的鎖陽(yáng)多糖對(duì)H2O2 損傷的VERO 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響(n=6)Fig.5 Effect of different concentrations of ploysccharide from Cynomorium songaricum Ruhr on H2O2-induced intracellular accumulation of ROS in VERO cells (n=6)

2.7 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果 表2 數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，模型組的MDA 水平顯著升高(#P ＜0.01);SOD 和GSH-Px 活力顯著降低(#P ＜0.01)，說(shuō)明H2O2對(duì)VERO 細(xì)胞造成了損傷，使得細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA 水平升高，使得細(xì)胞內(nèi)SOD 和GSH-Px活力降低，清除自由基能力下降。與H2O2模型組相比，多糖組的MDA 水平降低(＊＊P ＜0.01)，SOD 和GSH-Px 活力升高(＊＊P ＜0.01)，表明鎖陽(yáng)多糖具有抗氧化能力。

表2 鎖陽(yáng)多糖對(duì)SOD 和GSH-Px 活性以及MDA 水平影響(n=6)Tab.2 Effect of polysaccharide from Cynomorium songaricum Rupr on the activities of SOD，GSH-Px and MDA of VERO cell (n=6)

3 討論

正常的VERO 細(xì)胞自身?yè)碛幸惶浊宄杂苫拿赶到y(tǒng)，能將新陳代謝中生成的自由基清除，當(dāng)細(xì)胞受到外界的氧化損傷時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的自由基超過(guò)了其自身的自由基清除能力，過(guò)多的自由基使得細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸被氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的液態(tài)性、流動(dòng)性和通透性均發(fā)生變化，最終使膜功能發(fā)生障礙，引發(fā)腎結(jié)石等疾?。?3］。由于腎臟疾病難以在原位進(jìn)行研究，利用體外培養(yǎng)腎上皮細(xì)胞建立氧化損傷模型，避免了全身神經(jīng)體液、激素水平及局部不同類(lèi)型細(xì)胞間的相互影響，為更深入的從細(xì)胞水平研究腎臟疾患提供了良好的模型［14］。

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)利用H2O2誘導(dǎo)的VERO 細(xì)胞損傷模型，研究鎖陽(yáng)多糖對(duì)VERO 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2對(duì)VERO 細(xì)胞具有氧化損傷作用，其損傷程度呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性(0 ～2 h)和劑量依賴(lài)性(0 ～1 mg/mL)。其中800 μmol/L 處理1 h 可使VERO 細(xì)胞產(chǎn)生顯著的損傷，而分離純化的鎖陽(yáng)多糖可顯著提高經(jīng)H2O2損傷后的VERO 細(xì)胞的存活率，使得損傷性VERO細(xì)胞LDH 的漏出量顯著降低，這可能是因?yàn)殒i陽(yáng)多糖對(duì)VERO 細(xì)胞膜起到了保護(hù)作用，從而阻止了LDH 很快釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。

活性氧如過(guò)氧化氫和羥自由基容易破壞生物分子，這可能最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死［15］。通過(guò)抗氧化劑去除多余的活性氧或抑制其生成可以有效地防止細(xì)胞氧化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鎖陽(yáng)多糖能夠明顯降低由H2O2引起的VERO 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的變化，并且有劑量依賴(lài)性。此外，H2O2處理后的VERO 細(xì)胞內(nèi)caspase-3 活性明顯升高，經(jīng)鎖陽(yáng)多糖預(yù)處理后，caspase-3 活性劑量依賴(lài)性的降低，這表明鎖陽(yáng)多糖能夠間接抑制H2O2引起的VERO細(xì)胞的凋亡，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，模型組的SOD 和GSH-Px 活性顯著下降，MDA 水平顯著升高。而不同質(zhì)量濃度的鎖陽(yáng)多糖處理后各組的抗氧化酶活性均有所升高，MDA 水平均降低，并且隨著多糖質(zhì)量濃度增大，作用越顯著，這表明鎖陽(yáng)多糖能夠提高VERO 細(xì)胞的抗氧化能力。

綜上所述，本研究通過(guò)使用H2O2建立VERO細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，觀察鎖陽(yáng)多糖對(duì)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)鎖陽(yáng)多糖可以増加細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，維持細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的正常水平，明顯減少細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的形成，并顯示出抗凋亡作用。這些綜合作用的結(jié)果，可能就是鎖陽(yáng)多糖能夠起到保護(hù)VERO細(xì)胞作用的重要因素，這個(gè)結(jié)果為進(jìn)一步研究鎖陽(yáng)多糖潛在的防治腎臟相關(guān)疾病展示了樂(lè)觀的前景。

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