何鐵光，魏源文，龔明霞，鄧智年，董文斌，張朝明，趙坤（.廣西農業(yè)科學院蔬菜研究所，南寧，50007；2.廣西農業(yè)科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所；.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室）

辣椒耐熱基因的AFLP分析

何鐵光1，2，魏源文3，龔明霞1，鄧智年3，董文斌1，張朝明1，趙坤1
（1.廣西農業(yè)科學院蔬菜研究所，南寧，530007；2.廣西農業(yè)科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所；3.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室）

用辣椒耐熱自交系A11和熱敏自交系B22配置雜交組合，通過高溫脅迫處理鑒定其F2代分離群體的耐熱性。從123對Taq I/Ase I引物組合中篩選出6對多態(tài)性好的引物對F2代耐熱、熱敏植株進行AFLP分析，共擴增出約11 400條清晰條帶，其中2條為穩(wěn)定的差異，初步獲得了2個與辣椒耐熱性狀相關的AFLP分子標記。研究有助于開展辣椒耐熱基因的分子標記輔助選擇工作，提高辣椒育種效率和水平，并為分離和克隆辣椒耐熱相關功能基因奠定基礎。

辣椒；耐熱基因；AFLP分析

辣椒（Capsicum annuum L.）原產于中南美洲，屬于茄科（Solanaceac）辣椒屬（Capsicum）。辣椒是重要蔬菜作物，在世界各地廣泛栽培，因其營養(yǎng)豐富、富含維生素C等營養(yǎng)物質而深受人們喜愛[1]。我國是世界辣椒種植面積最大的國家，國內的種植面積僅次于大白菜，屬于第二大蔬菜作物。近年來，辣椒在華南地區(qū)也有了較大的種植面積，但廣西、海南等省份地處熱帶、亞熱帶地區(qū)，四季高溫多雨，對辣椒的生長發(fā)育造成了極大的影響，當氣溫高于35℃時，辣椒開花及結實均受到了明顯的影響，大大降低了辣椒的品質和產量。近10多a來，已有不少學者對高溫脅迫下辣椒的植株形態(tài)、生理生化指標進行了研究，但從分子水平系統(tǒng)研究辣椒耐熱特性的報道較少[2～6]。本研究以辣椒耐熱高代自交系A11與辣椒熱敏高代自交系B22雜交的F2代植株為材料，進行了耐高溫脅迫后，選擇耐熱和熱敏的植株進行AFLP分析，尋找與辣椒耐熱性狀相關的分子標記，為辣椒耐熱相關功能基因的克隆分析及進行分子標記輔助育種提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為辣椒耐熱高代自交系A11與辣椒熱敏高代自交系B22雜交的F2代植株，采用大棚栽培和人工氣候箱盆栽方式種植。試驗所需生化試劑、酶類購自南寧宏泰、Fermentas公司及 New Englad公司。AFLP分析所用接頭和引物由捷瑞公司合成，相關信息如下。

Ase I接頭序列：5'-TAGGTACGCAGTCTAC-3'；5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'；Ase I預擴增引物序列：5'-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3'；Ase I選擇性擴增引物序列：5'-GACTGCGTACCTAATNNN-3'，N為A、T、C、G堿基的任意一種。Taq I接頭序列：5'-GACGATGAGTCCTGAC-3'；5'-CGGTCAGGACTCAT-3'；Taq I預擴增引物序列：5'-GACGATGAGTCCTGACCGA-3'；Taq I選擇性擴增引物序列：5'-GATGAGTCCTGACCGANNN-3'，N為A、T、C、G堿基的任意一種。

1.2 辣椒葉片總DNA的提取及酶切反應

利用改良SDS法小量提取F2代耐熱及熱敏辣椒植株葉片的總DNA，對所提取的總DNA分別進行抽提純化和電泳檢測。

利用限制性內切酶Taq I和Ase I對總DNA進行酶切反應，酶切產物回收純化后備用。

1.3 接頭退火及連接反應

Ase I接頭和Taq I接頭退火，然后與DNA雙酶切反應產物于16℃連接過夜，連接產物保存于-20℃冰箱備用。

1.4 AFLP分析

①預擴增反應 分別以所有樣品的連接產物為模板，用與Taq I接頭、Ase I接頭匹配的預擴增引物進行預擴增反應，反應程序是94℃5 min、94℃80s、52℃60s、72℃90 s，20個循環(huán)；72℃10min。預擴增產物按需要進行不同倍數的稀釋備用。

②選擇性擴增 預擴增產物分別稀釋成5倍、10倍、15倍和20倍的工作用液，篩選合適的擴增模板濃度。利用選擇性擴增引物對A11、B22雜交F2代辣椒植株進行AFLP分析，94℃3 min；94℃80 s，65℃60 s，72℃90 s，每循環(huán)退火溫度下降0.7℃，反應12個循環(huán)；然后94℃3 min；94℃80 s，56℃60 s，72℃90 s，23個循環(huán)；延伸72℃10 min。

③電泳檢測 配制6%丙烯酰胺變性凝膠，電泳及銀染參照王關林等[7]的方法。

2 結果與分析

2.1 辣椒葉片總DNA的提取

用SDS法從辣椒葉片中提取的總DNA的OD260/OD280比值在1.8左右，在1%的瓊脂糖凝膠中樣品帶清楚、凝膠背景清晰（圖1），經過RNase A處理和酚/氯仿抽提后適用于酶切、連接等試驗。

2.2AFLP反應體系的建立

在預擴增反應中，進行濃度測定，根據濃度的大小稀釋10～20倍后用作AFLP預擴增的模板，進行預擴增條件優(yōu)化研究。結果表明，以連接產物的10倍稀釋液為模板，擴增20循環(huán)的效果最好，預擴增產物主要集中在100～750 bp（圖2）。

選擇性擴增以預擴增產物稀釋15倍為模板，擴增約35個循環(huán)效果較好（包括降落PCR部分）。循環(huán)數少，獲得的擴增產物濃度低，在變性聚丙烯酰胺凝膠中條帶顏色較淺，通過延長顯色時間可以增加條帶的清晰度，但是也導致了凝膠背景增加；循環(huán)數過多時擴增產物的濃度過高和非特異條帶增多，變性凝膠中模糊的弱條帶增多，重復效果不穩(wěn)定。

圖1 SDS法提取辣椒葉片的總DNA 1～15表示辣椒葉片總DNA。

圖2 預擴增產物的電泳檢測

圖3 辣椒耐熱性狀相關基因的AFLP分析

2.3 辣椒耐熱基因的AFLP分析

本研究利用123對引物組合對辣椒耐熱、熱敏基因池進行了引物篩選，從中選擇6對多態(tài)性較好的引物組合對辣椒F2代植株進行AFLP分析。聚丙烯酰胺變性凝膠電泳結果顯示，每個樣品的擴增條帶多數在30～70條，獲得11 400條穩(wěn)定、清晰條帶。其中A8T19和A12T15引物組合的擴增結果中，耐熱辣椒品種中分別出現1條穩(wěn)定的差異條帶，推斷該差異條帶與辣椒耐熱性狀相關，至于確切關系還有待進一步分析驗證。

3 討論與結論

AFLP分析多態(tài)性豐富、靈敏度高、重復性好[8，9]，在植物分子標記研究中應用廣泛，但DNA模板的質量高低及銀染操作水平均對其分析結果產生重要影響，尤其在銀染中無水碳酸鈉（Na2CO3）質量、漂洗操作及顯色時間的控制對條帶的清晰度和凝膠的背景的影響尤為突出[10]。

辣椒材料的高溫脅迫試驗結果的判定對利用AFLP技術分析辣椒耐熱性狀相關基因的結果有十分重要的影響。本研究的高溫脅迫試驗中，在42℃、相對濕度75%的條件下保持一定時間后，根據辣椒植株的形態(tài)特征去判定F2代植株的耐熱性，主觀的判定標準會對AFLP分析結果產生影響；如能結合分析高溫脅迫下辣椒的生理生化指標，可以提高判定F2代植株的耐熱、熱敏性的準確性[11]。在AFLP分析中耐熱、熱敏辣椒材料之間的差異條帶是否與耐熱性狀相關或連鎖還需要進一步的回收克隆及進行功能分析來加以確定。

[1]顧曉慧.與辣椒抗根結線蟲N基因緊密連鎖的AFLP標記的開發(fā)[D].呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學，2006.

[2]金新文，沈征言.高溫脅迫下三種蔬菜抗熱性不同的品種間葉片蒸騰強度作用的比較[J].石河子大學學報：自然科學版，1997，1（3）：195-198.

[3]姚元干，石雪暉，楊建國，等.辣椒葉片耐熱性生理生化指標探討[J].湖南農業(yè)大學學報，1998，24（2）：119-122.

[4]賈志銀，鞏振輝，許紅娟，等.高溫脅迫對辣椒幼苗生長及生理性狀的影響[J].北方園藝，2010（12）：5-8.

[5]姚元干，石雪暉，楊建國，等.辣椒耐熱性與葉片質膜透性及幾種生化物質含量的關系 [J].湖南農業(yè)大學學報，2000，26（2）：97-99.

[6]徐小萬，雷建軍，羅少波，等.高溫高濕對現蕾期辣椒不同品種抗氧化性差異研究[J].核農學報，2010，24（2）：394-400.

[7]王關林，張宏筠.植物基因工程[M].北京：科學出版社，2002.

[8]Kehoe D M,Villand P,Omerille S.DNA microarrays for studies of higher plants and other photosynthetic organisms [J].Trends plant sci.,1999,4（1）：38-41.

[9]Diachenko L B,Ledesma J,Chenchik A A,et al.Combining the technique of RNA fingerprinting and differential display to obtain differentially expressed mRNA[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,219（3）：824-828.

[10]魏源文，鄧智年，黃誠梅，等.乙烯利調控甘蔗基因的差異表達研究[J].南方農業(yè)學報，2011，42（1）：6-10.

[11]何鐵光，董文斌，王愛勤，等.高溫脅迫下辣椒生理生化響應機理初步探討[J].西南農業(yè)學報，2013，26（2）：541-544.

Identification of AFLP Markers Linked to Heat-resistant Genes in Hot Pepper

HE Tieguang1,2,WEI Yuanwen3,GONG Mingxia1,DENG Zhinian3, DONG Wenbin1,ZHANG Chaoming1,ZHAO Kun1

A hybridization between hot pepper heat-resistant inbred line A11 and thermosensitive inbred line B22 was made for mapping heat-resistant gene(s),and the heat resistance of their F2segregation populations was identified through high temperature stress test.With six Taq I/Ase I primers with high polymorphism screened from 123 primer combinations, AFLP(amplified fragment length polymorphism)analysis was performed on resistant and thermosensitive F2plants.A total of about 11 400 distinguishable bands were amplified,of which two were stable difference.Two AFLP markers relevant to heat resistance of hot pepper were obtained preliminarily.The research not only helped to improve the breeding efficiency and level of hot pepper by using marker-assisted selection of heat-resistant genes,but also laid the foundation for the separation and cloning of related heat-resistant functional genes of hot pepper.

Hot pepper;Heat-resistant genes;AFLP analysis

Q785；S641.3

：A

：1001-3547（2014）04-0024-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2014.04.010

廣西自然科學基金項目（2011GXNSFA018106）；廣西科學研究與技術開發(fā)項目（桂科合：1140010-7）；南寧市興寧區(qū)科學研究與技術開發(fā)項目（2010028）；廣西農業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項項目 （桂農科2011YM11）；廣西農業(yè)科學院科技成果轉化項目[201003（轉）]

何鐵光（1976-），男，博士，副研究員，主要從事蔬菜遺傳育種與栽培及環(huán)境生態(tài)研究，電話：13978684761，

E-mail：tghe118@163.com

2013-07-16