孟 雪 王志英

(1．黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學院，黑龍江 哈爾濱 150025;2．東北林業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

碰碰香(Pelargonium odoratissimum)牻牛兒苗科天竺葵屬植物，原產(chǎn)地在歐洲及西南亞地區(qū)，耐熱，不耐寒，喜陽光。因觸碰后可散發(fā)出令人舒適的香氣而享有“碰碰香”的美稱，其氣味如薄荷，又略帶蘋果風味，具有提神醒腦，清熱解暑，驅(qū)避蚊蟲，消炎消腫和保養(yǎng)皮膚的功效［1，2］。目前，對碰碰香揮發(fā)油化學成分分析及抑菌活性的研究未見報道。為此，筆者對碰碰香揮發(fā)油的成分進行了定性定量分析，并探討其抑菌活性，尋找真正抑菌成分和天然抗菌物質(zhì)，為其藥用價值的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

(1)供試植物。碰碰香購自黑龍江省哈爾濱市花卉市場。

(2)供試菌種?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)、綠膿桿菌(Pseudomonas paeruginosa)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)由東北林業(yè)大學森林保護學科國家林業(yè)局重點驗室提供。培養(yǎng)基為LB 培養(yǎng)基。

1．2 方法

(1)揮發(fā)油的提取。將新鮮碰碰香的地上部分晾干后粉碎，稱取100g 粗粉，用水蒸氣蒸餾法［3］提取其揮發(fā)油，蒸餾時間4h，餾出物用石油醚萃取得淺黃色液體，用無水硫酸鈉干燥后冰箱中保存。

(2)GC-MS 儀器與分析條件。儀器:美國Hewlett-Packard 公司生產(chǎn)的HP 6890 puls/HP5973 GC/MS 聯(lián)用儀;GC 條件:HP-5ms 石英毛細管柱(30m×0．25mm ×0．25μm)。載氣為氦氣，流速1mL·min－1，汽化室溫度280℃。程序升溫，柱初溫80℃(2min);80℃～180℃(0min)，0℃·min－1;180℃～250℃，7．5℃·min－1，柱終溫250℃(2min)。柱流量60mL·min－1，進量樣1μL，分流比30∶1。MS 條件:離子源為EI，離子源溫度230℃。電子能量70eV，四極桿溫度150℃，掃描質(zhì)量范圍50～500amu。標準譜庫為美國DATABASE/NIST98．L 譜庫，結(jié)合有關文獻人工檢索確定其化學組成［4］。各成分的保留指數(shù)，與文獻［5］化合物的保留指數(shù)進行比較，進一步確證各化合物。采用峰面積歸一法計算各峰的百分比含量。

(3)菌懸液的制備。將供試菌種用LB 斜面培養(yǎng)基活化，接種LB 液體培養(yǎng)基，搖床37℃恒溫震蕩24h，得到供試菌液，以無菌生理鹽水制成含106～107cfu·ml－1個細菌的菌懸液。

(4)揮發(fā)油抑菌圈的測定。采用濾紙片法［6］依次吸取100μl 各供試菌液，分別加入到LB 平板培養(yǎng)基上，用無菌玻璃三角涂棒涂布均勻。用打孔器將濾紙打成直徑5mm 的圓片，高壓滅菌后放入已涂菌的平板內(nèi)，每片滴加20μl 揮發(fā)油，對照滴加20μl 無菌水。每次實驗3 次重復，每個平板貼放4 片實驗樣片，1 片對照樣片。平皿置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑(mm)，計算抑菌圈直徑。公式如下:

抑菌圈直徑(mm)=測量抑菌圈直徑平均值－5

(5)揮發(fā)油有效抑菌中濃度的測定。用含5%吐溫-80的無菌水將碰碰香揮發(fā)油分別稀釋為100mg·ml－1、50mg·ml－1、10mg·ml－1、5mg·ml－1、2．5 mg·ml－1和1．25 mg·ml－1，然后在各培養(yǎng)皿中分別加入1ml 稀釋后的揮發(fā)油和9ml 55℃LB 固體培養(yǎng)基混勻，依次制成含10mg·ml－1、5mg·ml－1、1mg·ml－1、0．5mg·ml－1和0．25mg·ml－1和0．125 mg·ml－1含揮發(fā)油的平板培養(yǎng)基，待平板培養(yǎng)基凝固后取10μl 含106～107cfu·ml－1個細菌的菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基表面，每濃度重復3 次。以接菌懸液無揮發(fā)油的LB 固體培養(yǎng)基為陽性對照，以無菌懸液含揮發(fā)物的LB 固體培養(yǎng)基為陰性對照。置于37℃恒溫培養(yǎng)24h 后觀察計數(shù)，按如下公式計算抑菌率［7］:

抑菌率(%)=(對照菌落數(shù)－處理菌落數(shù))/對照菌落數(shù)×100%計算出抑菌率

采用SPSS10．0 軟件中的概率單位回歸法［8］測定碰碰香揮發(fā)油對供試細菌的EC50，P ＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2．1 碰碰香揮發(fā)油化學組成

經(jīng)GC-MS 分析，得到總離子色譜圖(見圖1)。從碰碰香揮發(fā)油中分離得到的化合物中，共鑒定出20 種化合物(見表1)，占總揮發(fā)油的92．36%，其中單萜類化合物占總揮發(fā)油的91．29%，相對百分含量最多的兩種單萜類化合物分別是羅勒烯和α-蒎烯，其相對百分含量分別達到了53．95% 和15．48%，其次是莰烯7．42%，檜烯5．52%，β-蒎烯5．08%。

表1 碰碰香揮發(fā)油組分分析

2．2 抑菌圈直徑的測定

參照北京藥品檢驗所指定的常規(guī)抗生素藥敏抑菌圈標準［9］，抑菌圈在1．5cm 以上為抑菌能力強，用“+++”表示;1～1．5cm 為抑菌能力較強，用“++”表示;1cm 以下為抑菌能力弱，用“+”表示;無抑菌圈出現(xiàn)為無抑菌能力，用“－－ ”表示。

表2 碰碰香揮發(fā)油的抑菌圈直徑

同濃度的碰碰香揮發(fā)油對6 種供試細菌進行抑菌實驗，結(jié)果如表2 所示。其中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到了1．5cm 以上;其次是炭疽芽孢桿菌，其抑菌圈直徑在1～1．5cm 之間;再次是枯草芽孢桿菌、玫瑰色微球菌、綠膿桿菌，其抑菌直徑都在1cm 以下;而對腐生葡萄球菌抑菌效果不明顯。

2．3 有效抑菌中濃度的測定

由于在抑菌圈實驗中碰碰香揮發(fā)油對腐生葡萄球菌抑菌效果不明顯，故在抑菌率實驗中只對其余5 種細菌進行測定。由表3 可知:揮發(fā)油在10mg·ml－1濃度時對5 種細菌的抑菌率都是100%，隨著濃度的降低，抑菌率也隨之降低，當降低到某一濃度時揮發(fā)油就失去了抑菌能力。

表3 碰碰香揮發(fā)油對5 種細菌的抑菌率

根據(jù)表3 數(shù)據(jù)，利用SPSS 數(shù)據(jù)分析軟件中概率單位回歸功能，計算碰碰香揮發(fā)油對5 種細菌的有效抑菌中濃度(EC50)如表4 所示?？莶菅挎邨U菌的EC50是1．369 mg·ml－1，玫瑰色微球菌是1．520mg·ml－1，綠膿桿菌是1．461mg·ml－1，炭疽芽孢桿菌是1．349mg·ml－1，金黃色葡萄球菌是0．127mg·ml－1。由此可見，碰碰香揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。

表4 碰碰香揮發(fā)油對5 種細菌的有效抑菌中濃度(mg·ml －1)

3 討論

經(jīng)分析得知，碰碰香揮發(fā)油其主要成分是單萜類化合物，相對百分含量占總揮發(fā)油的91．29%，其中以羅勒烯(53．95%)和α-蒎烯(15．48%)含量最多，其次是莰烯(7．42%)、檜烯(5．52%)和β-蒎烯(5．08%)。根據(jù)醫(yī)療上的經(jīng)驗，這些單萜類化合物具有驅(qū)蟲、殺蟲、抗風濕、抗腫瘤、利尿、祛痰、止瀉和鎮(zhèn)靜等作用，因此具有很高的醫(yī)藥價值［10］。

實驗證明，碰碰香揮發(fā)油具有很強的抗菌、殺菌作用，對除腐生葡萄球菌以外的5 種供試細菌都表現(xiàn)出較強的抑制效果，且揮發(fā)油濃度越大，抑菌作用越強。其中揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑在1．5cm 以上，EC50為0．127mg·ml－1;其次是炭疽芽孢桿菌，其抑菌圈直徑在1～1．5cm 之間;EC50為1．349mg·ml－1。因此，碰碰香揮發(fā)油在體內(nèi)抗細菌感染方面具有一定作用，有關其抗菌機理和其他生物活性有待進一步探討。

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