張進(jìn)松，辛 輝*，李曉丹，段德麟

1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，青島 266003;2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合中心，青島 266021;3 中國科學(xué)院海洋研究所，青島 266071

瘦素(Leptin)主要由白色脂肪組織合成和分泌，是一種多肽類激素，與其受體結(jié)合后可發(fā)揮調(diào)節(jié)食欲、脂質(zhì)代謝的作用［1］。研究表明［2］，許多肥胖患者，尤其是伴隨高脂血癥的肥胖患者血清瘦素水平增高，提示存在瘦素抵抗。海帶多糖主要由褐藻膠(algin)、褐藻糖膠(fucoidan)、褐藻淀粉(1aminaran)組成，具有提高機(jī)體免疫力、抗衰老、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性［3］。研究證實(shí)［4］，海帶多糖可以降低血脂及瘦素水平，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過建立高脂血癥小鼠動物模型，應(yīng)用海帶多糖藥物干預(yù)，檢測小鼠血清瘦素及下丘腦瘦素受體的表達(dá)水平，探討海帶多糖對血脂水平的調(diào)節(jié)作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型及分組

清潔級健康雄性昆明小鼠80 只(體質(zhì)量22～27 g)，由青島市藥物檢驗(yàn)所動物中心提供［SCXK(魯)20110010］。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，隨機(jī)取10 只小鼠處死取血測定正常空腹血脂水平。再隨機(jī)取20只作為正常對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，剩余50 只為高脂飼料組，給予高脂飼料(配比:普通飼料59%，蔗糖20%，豬油10%，蛋黃粉10%，膽酸鈉1%)喂養(yǎng)。4 周后隨機(jī)取高脂飼料組小鼠10 只處死測定血脂水平，以血清甘油三酯、膽固醇水平高于正常水平2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為高脂血癥模型建立成功的標(biāo)志。將造模成功的40 只小鼠隨機(jī)分為高脂模型組、海帶多糖治療組，各20 只。

1.2 干預(yù)措施

正常對照組繼續(xù)予以普通飼料喂養(yǎng)，高脂模型組和海帶多糖治療組改為普通飼料喂養(yǎng)。用生理鹽水將海帶多糖(中國科學(xué)院海洋研究所提供)配制成300 mg/mL 混合液，根據(jù)前期研究［5］所得的有效劑量(3.00 g/kg)灌胃治療，每日1 次，連續(xù)2 周。對照組和模型組同步給予等量生理鹽水。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 血脂檢測

小鼠禁食12 h 經(jīng)心臟取血1 mL 置于紅頭真空采血管內(nèi)靜置10 min，4000 rpm 離心10 min，分離血清，日立7600 生化分析儀測血脂水平，剩余血清-20℃保存。

1.3.2 血瘦素檢測

取上述血清標(biāo)本，室溫復(fù)溶，按瘦素(Leptin)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(T-32203，安迪科技公司，美國)說明操作，酶標(biāo)儀(BioTek 公司ELx800型號，美國)在450 nm 處測定吸光度值，根據(jù)樣品吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線坐標(biāo)上找出對應(yīng)的血清Leptin(μg/L)水平。

1.3.3 免疫組化法檢測下丘腦OBR 水平

每組隨機(jī)取小鼠5 只經(jīng)心臟取血后用輸液器針頭刺入左心室內(nèi)，剪破右心耳，NS 50 mL 沖洗，4%多聚甲醛溶液50 mL 灌注，取腦組織，生理鹽水洗滌，4%多聚甲醛溶液固定2 h，蒸餾水浸泡4 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續(xù)5 μm切片，貼于多聚賴氨酸處理的載玻片上。石蠟切片脫蠟至水，按試劑盒說明書操作(兔抗小鼠OBR 一抗由abcam 公司提供，免疫組化試劑盒(SP-90001，北京中杉生物公司)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。在400 倍光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)不重疊的視野，Image-Pro Plus 軟件分析組織OBR 吸光度值(A)，以陽性細(xì)胞A 減去背景A 表示OBR 表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.4 Western blot 檢測OBR 蛋白表達(dá)

每組隨機(jī)取小鼠7 只，生理鹽水50 mL 經(jīng)心臟灌注后，取下丘腦組織，提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜，加一抗(OBR，Ab5593，1:2000;GAPDH，TA-08，1:10000)、二抗(Ab6721，1:5000)孵育，A、B 液顯影，Vilber Fusion FX7 系統(tǒng)成像，Quantity One 軟件圖像分析。以目的蛋白OBR(125kD)與內(nèi)參GAPDH(36kD)灰度值的比值表示OBR 的相對含量。

1.3.5 RT-PCR 檢測OBR mRNA 量

剩余小鼠取下丘腦方法同上，應(yīng)用Trizol 試劑(Invitrogen 公司)提取總RNA，紫外分光光度計(jì)(K5500，北京凱奧科技公司)測RNA 豐度。逆轉(zhuǎn)錄:OBR 上游引物5'-AAC TCA ACT ACG CTC TTC TG-3'，下游引物5'-CCA TCA TCT GTG ACT TCC AT-3'，產(chǎn)物長度142 bps;內(nèi)參GAPDH 上游引物5'-AAC CTG CCA AGT ATG ATG A-3'，下游引物5'-GGA GTT GCT GTT GAA GTC-3'，產(chǎn)物長度119 bps［6］。擴(kuò)增基因:95 ℃預(yù)變性10 min，98 ℃變性10 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min(Takara DRR014A PrimeScript?RTPCR Kit)。取適量擴(kuò)增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳(110V/40A)30 min，溴化乙錠染色，Vilber Lourmat系統(tǒng)成像，Quantity One 軟件分析PCR 產(chǎn)物條帶灰度值。以目的基因與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值表示OBR 基因的相對豐度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 血脂(TG、TC、LDL)、血清Leptin 水平

血脂及血清Leptin 水平組間有顯著性差異(FTG=96.80，F(xiàn)TC=115.30，F(xiàn)LDL=41.83，F(xiàn)Leptin=13.51，P＜0.01)，其中模型組較對照組顯著升高(tTG=11.82，tTC=12.38，tLDL=7.74，tLeptin=5.24，P＜0.01)，治療組較模型組均顯著降低(tTG=9.90，tTC=11.80，tLDL=6.50，tLeptin=3.98，P＜0.01)，治療組與對照組無顯著性差異(tTG=2.00，tTC=1.37，tLDL=1.11，tLeptin=1.09，P ＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血脂、血清Leptin 水平(，n=15)Table 1 Blood lipid and serum leptin level of different groups

表1 各組小鼠血脂、血清Leptin 水平(，n=15)Table 1 Blood lipid and serum leptin level of different groups

a與對照組比較，P＜0.01;b 與模型組比較，P＜0.01;c 與對照組比較P ＞0.05。a Compared with the control group，P＜0.01;b Compared with the model group，P＜0.01;cCompared with the control group，P ＞0.05.

2.2 免疫組織化學(xué)測得下丘腦OBR 的表達(dá)

各組小鼠下丘腦OBR 表達(dá)水平比較有差異(F=170.51，P＜0.01)，模型組表達(dá)水平較對照組顯著降低(t=5.55，P＜0.01)，治療組較模型組顯著升高(t=18.03，P＜0.01)，治療組較對照組亦有顯著性升高(t=12.48，P＜0.01)。見圖1，表2。

圖1 對照組(A)、模型組(B)及治療組(C)下丘腦OBR 免疫組化染色I(xiàn)H×400Fig.1 OBR expression in hypothalamus of control group (A)，model group (B)and treatment group (C)，immunohistochemical study IH×400

2.3 Western bloting 和RT-PCR 測得下丘腦OBR相

對照組、模型組和治療組小鼠下丘腦OBR 表達(dá)水平比較有顯著性差異(FWB=10.36，F(xiàn)PCR=15.46，P＜0.01)，模型組表達(dá)水平較對照組顯著降低(tWB=2.14，tPCR=2.74，P＜0.05)，治療組較模型組顯著升高(tWB=4.59，tPCR=5.42，P＜0.01)，治療組較對照組亦有顯著性升高(tWB=2.56，tPCR=2.90，P＜0.05)。見圖2，表2。

圖2 各組下丘腦OBR 相對豐度的比較(左為WB，右為PCR)Fig.2 OBR relative expression of different groups (left for WB，right for PCR)

表2 各組小鼠免疫組化、PCR 及WB 測得OBR 相對豐度(，nIHC=5，nWB=7，nPCR=8)Table 2 Immunohistochemistry，PCR and WB measured OBR relative expression of different groups

表2 各組小鼠免疫組化、PCR 及WB 測得OBR 相對豐度(，nIHC=5，nWB=7，nPCR=8)Table 2 Immunohistochemistry，PCR and WB measured OBR relative expression of different groups

a與對照組比較，P＜0.05;b 與模型組比較，P＜0.01;c 與對照組比較P＜0.05。aCompared with the control group，P＜0.05;b Compared with the model group，P＜0.01;cCompared with the control group，P＜0.05.

3 討論

高脂血癥是指人體脂質(zhì)代謝障礙導(dǎo)致的血漿膽固醇、甘油三酯水平的升高，與動脈粥樣硬化關(guān)系密切。高血脂可引起機(jī)體氧化與抗氧化狀態(tài)的失衡，氧自由基產(chǎn)生增加，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化并破壞內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)粥樣斑塊的形成［7，8］。臨床資料顯示，高脂血癥患者往往伴有血清瘦素水平的升高［2，9］，提示高脂血癥患者可能存在瘦素抵抗。瘦素受體主要包含短型OBRa 和長型OBRb，存在于大腦脈絡(luò)叢和血腦屏障微血管叢的OBRa 可以調(diào)節(jié)瘦素通過血腦屏障，OBRb 主要存在于下丘腦表達(dá)神經(jīng)肽Y(NPY)的細(xì)胞表面，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，是執(zhí)行瘦素功能的主要受體［10］。瘦素抵抗主要涉及兩種機(jī)制:中樞性瘦素抵抗(central leptin resistance)和外周性瘦素抵抗(peripheral leptin resistance)，主要發(fā)生在3個(gè)環(huán)節(jié):瘦素通過血腦屏障向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙(外周性抵抗)，瘦素受體突變(OB-Rb 突變引起中樞性抵抗，OB-Ra 等短型受體突變引起外周性抵抗)，受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常(中樞性抵抗)［11］。有實(shí)驗(yàn)也表明增加外周瘦素或OB-Ra 短型受體含量有助于改善瘦素抵抗［12，13］。

本研究表明，高脂血癥小鼠血清Leptin 水平代償性升高，且未能使血脂恢復(fù)正常水平，說明存在瘦素抵抗，高水平的瘦素刺激下丘腦OBR，導(dǎo)致下丘腦OBR 下調(diào)，進(jìn)一步加劇瘦素抵抗。應(yīng)用海帶多糖干預(yù)后，高脂血脂小鼠的Leptin 水平下降，下丘腦OBR 的水平升高，明顯改善了瘦素抵抗，并使血脂恢復(fù)至正常水平。其可能機(jī)制為:海帶多糖通過提高中樞OBR 的水平，一方面促進(jìn)中樞OBRa 介導(dǎo)的血清Leptin 向腦脊液轉(zhuǎn)移，另一方面下丘腦OBRb與Leptin 的結(jié)合量升高，明顯改善瘦素抵抗，極大發(fā)揮了Leptin 的生物學(xué)作用:降低脂肪的攝入，抑制脂肪的合成，增加脂質(zhì)的消耗［14］，從而使血脂水平恢復(fù)正常。另外海帶多糖也可能有直接降血脂作用或通過其他途徑改善血脂水平，故而關(guān)于海帶多糖的降血脂作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1 Paz-Filho G，Mastronardi C，F(xiàn)ranco CB，et al.Leptin:molecular mechanisms，systemic pro-inflammatory effects，and clinical implications.Arq Bras Endocrinol Metabol，2012，56:597-607.

2 Schutte AE，Huisman HW，Schutte R，et al.Adipokines and cardiometabolic function:How are they interlinked?Regul Pept，2010，164(2-3):133-138.

3 Li X，Yu Z，Long S，et al.Hypoglycemic effect of Laminaria Japonica polysaccharide in a type 2 diabetes mellitus mouse model.ISRN Endocrinology，2012，3(10):1-4.

4 Xin H，Tian JW，Yu ZQ，et al.Laminaria japonica polysaccharide reduces lipids and leptin levels in hyperlipedemic mice.Basic Res J Med Clin Sci，2013，2(2):22-26.

5 Tian JW(田嘉偉)，Long SH(龍少華)，Li XD(李曉丹)，et al.The Effect of Laminaria Japonica Polysaccharide on Lipids and Leptin Levels of Hyperlipemia Mice.Chin J Mar Drugs(中國海洋藥物雜志)，2012，31(6):37-40.

6 Lundh SH，Soylu R，Petersén A.Expression of mutant huntingtin in leptin receptor-expressing neurons does not control the metabolic and psychiatric phenotype of the BACHD mouse.PLoS One，2012，7:e51168.

7 Iversen A，Jensen JS，Scharling H，et al.Hypercholesterolaemia and risk of coronary heart disease in the elderly:impact of age:the Copenhagen City Heart Study.Eur J Intern Med，2009，20(2):139-144.

8 Patel SB，Reams GP，Spear RM，et al.Leptin:linking obesity，the metabolic syndrome，and cardiovascular disease.Curr Hypertens Rep，2008，10(2):131-137.

9 van de Woestijne AP，Monajemi H，Kalkhoven E，et al.Adipose tissue dysfunction and hypertriglyceridemia:mechanisms and management.Obes Rev，2011，12:829-840.

10 Margetic S，Gazzola C，Pegg GG，et al.Leptin:a review of its peripheral actions and interactions.Int J Obes Relat Metab Disord，2002，26:1407-1433.

11 Ding WL(丁文玲)，Liu CY(劉長云)，Song MY(宋茂媛)，et al.Effect of Leptin Resistance and Leptin Receptor Gene Mutation on Lipid Metabolism in Simple Obese Children.J Appl Clin Petiatr(實(shí)用兒科臨床雜志)，2012，27:492-494.

12 Prieur X，Tung YC，Griffin JL，et al.Leptin regulates peripheral lipid metabolism primarily through central effects on food intake.Endocrinology，2008，149:5432-5439.

13 Delgado MG，Gracia-Sancho J，Marrone G，et al.Leptin receptor blockade reduces intrahepatic vascular resistance and portal pressure in an experimental model of rat liver cirrhosis.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2013，305:G496-502.

14 Pilka L，Rumpík D，Pilka R.Role of leptin in human reproduction (anorexia，bulimia).Ceska Gynekol，2012，77:484-485.