辛 敏，黃 昀，郝鵬飛，詹 欣，唐勁天*，盛 軍

1北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102;2 清華大學(xué)工程物理系粒子技術(shù)與輻射成像教育部重點實驗室，北京 100084;3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，普洱茶學(xué)教育部重點實驗室，昆明 650201

鷹嘴豆(Cicer arietinum L.)是豆科鷹嘴豆屬植物，作為重要的植物蛋白來源廣泛種植于世界諸多地區(qū)，具有極高的營養(yǎng)價值［1］。同時，鷹嘴豆是重要的維吾爾醫(yī)用傳統(tǒng)藥材，具有悠久的藥用歷史，對缺鐵性疾病引起的乏力、食欲不振、皮膚瘙癢等癥狀具有明顯改善作用。植物鐵蛋白是廣泛存在于動物、植物及微生物體中的一種鐵貯藏蛋白，由24 個同源或異源亞基所結(jié)合成的一個蛋白質(zhì)復(fù)合體。目前已在豆科植物，如大豆、豌豆、黃豆、蠶豆、黑豆、紅小豆、羽扇豆中都發(fā)現(xiàn)了植物鐵蛋白的存在。鐵蛋白是植物光合作用和固氮等生化反應(yīng)的鐵源，具有調(diào)節(jié)生物體細胞內(nèi)鐵代謝平衡的功能［2］。作為一種重要的脅迫反應(yīng)蛋白，鐵蛋白在植物發(fā)育中起了重要作用［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，植物鐵蛋白補鐵效果好，可有效地緩解鐵缺乏癥，且無毒副作用，是一種新型的天然鐵補充劑。同時，植物鐵蛋白還具有降脂降糖、抗腫瘤、抗氧化、抗HIV 等諸多生物活性［4］。

本研究以鷹嘴豆為研究對象，在單因素實驗基礎(chǔ)上采用正交實驗方法，綜合考慮生產(chǎn)成本及提取率等因素，成功優(yōu)化鐵蛋白的提取工藝，為其作為植物補鐵制劑進一步開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆于2011 年10 月購自新疆木壘縣，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所劉新民教授鑒定為豆科鷹嘴豆屬植物鷹嘴豆(Cicer arietinum L.);凱基Braford 蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純;二次蒸餾水;超純水。

himac CF 16RX 冷凍離心機(日本日立公司);iMark 酶標(biāo)儀(美國伯樂公司);MH-2 微量振蕩器(澳門市其林貝爾儀器制造有限公司);BM255C 攪拌機(美的集團有限公司);Venticell 烘箱(德國MMM 公司);Seven Easy 酸度計(美國梅特勒-托利多公司);NANOpure 超純水系統(tǒng)(美國巴恩斯特德公司);AL204-IC 電子天平(美國梅特勒-托利多公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fe2+濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的測定

準(zhǔn)確稱取FeSO4·7H2O 晶體1.0000 g，加水溶解并于10 mL 棕色容量瓶中定容。精密量取此溶液1 mL，加入100 mL 棕色容量瓶中稀釋至刻度，作為待測母液。精密移取母液0、1、2、3、4、5 μL 于96 孔板中，加水稀釋至180 μL，加入30 μL 20%連二亞硫酸鈉溶液還原后，再加入40 μL 0.1%鄰菲咯啉溶液染色。混勻，放置2 min 后，酶標(biāo)儀混勻10 s 在510 nm 波長下檢測吸光值。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。

1.2.2 鄰菲咯啉顯色法測定提取液中Fe2+含量

根據(jù)Fe2+與鄰菲咯琳絡(luò)合后顯特殊的桔紅色的反應(yīng)原理，在96 孔酶標(biāo)板小孔中加入10 μL 待測液，20 μL 超純水，30 μL 20%的連二亞硫酸鈉溶液還原后，再加入40 μL 0.1%鄰菲咯琳溶液，混勻，放置2 min 后，酶標(biāo)儀混勻10 s 在510 nm 波長下檢測［5］。根據(jù)所測吸光度，可計算Fe2+濃度=(吸光度-常數(shù)項)/回歸系數(shù)。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的測定

用凱基Braford 蛋白含量檢測試劑盒，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C，g/L)為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。

1.2.4 Bradford 分光光度法測定提取液中蛋白質(zhì)含量

利用考馬斯亮藍G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合顯藍色的特性，在96 孔酶標(biāo)板小孔中加入1 μL 待測液，4 μL超純水，195 μL 考馬斯亮藍G-250 染色后，混勻，放置2 min 后，酶標(biāo)儀混勻10 s 在570 nm 波長下檢測。根據(jù)所測吸光度，可計算總蛋白濃度=(吸光度-常數(shù)項)/回歸系數(shù)。

1.2.5 提取液干重的測定

精密量取7.5 mL 待測提取液于干燥培養(yǎng)皿中進行60 ℃鼓風(fēng)干燥直至恒重，平行測定3 次，即可測得提取液干重。

1.2.6 單因素實驗

參考袁小紅［5］豌豆種子鐵蛋白預(yù)處理及鹽析，增加種子勻漿后緩沖液清洗3 次(20、20、10 mL)步驟。分別考慮緩沖液種類(KH2PO4-NaOH 緩沖液、Tris-HCl 緩沖液)、pH 值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)、鹽析鹽種類(50 mmol/L 的MgCl2、飽和度為15%～20%的(NH4)2SO4、鹽析濃度(10、20、30、40、50、60、70、80 mmol/L)對鷹嘴豆鐵蛋白提取工藝的影響［6-9］。

采用1.2.2、1.2.4、1.2.5 方法進行鐵濃度、蛋白濃度、總提取物干重的測定。以鐵含量代表鐵蛋白含量，按如下公式分別計算鐵蛋白提取率，總蛋白提取率。

鐵蛋白提取率=稀釋倍數(shù)×Fe2+濃度×待測液體積/鷹嘴豆種子質(zhì)量

總蛋白提取率=稀釋倍數(shù)×總蛋白濃度×待測液體積/鷹嘴豆種子質(zhì)量

1.2.7 正交實驗優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素實驗結(jié)果及文獻［7］報道溫度對鐵蛋白提取的影響，確定鷹嘴豆種子中提取鐵蛋白的正交實驗因素和水平，采用SPSS 軟件進行L9(34)正交實驗設(shè)計，優(yōu)化鐵蛋白提取工藝，平行重復(fù)3次。

采用1.2.2、1.2.4、1.2.5 方法進行鐵濃度、蛋白濃度、干重的測定。

表1 鐵蛋白提取L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experimental design for extraction of ferritin

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

各實驗均重復(fù)3 次以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，所得實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0 處理行t 檢驗及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系及回歸方程

以1.2.1 方法測定Fe2+線性關(guān)系，得到Fe2+標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.142C-0.023，R2=0.9990。表明在4～20 μg/mL 范圍內(nèi)，F(xiàn)e2+濃度與吸光度呈線性關(guān)系。

以1.2.3 方法測定總蛋白線性關(guān)系，得到總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=19.400C+0.028，R2=0.9960。表明在0.005～0.025 g/L 定范圍內(nèi)，總蛋白濃度與吸光度呈線性關(guān)系。

2.2 單因素實驗

2.2.1 緩沖液種類的篩選

在緩沖液pH 7.0，50 mmol/L 的MgCl2鹽析，料液比1∶2 提取條件下，緩沖液種類對鷹嘴豆鐵蛋白提取的影響結(jié)果如表2 所示。

表2 不同緩沖液下鐵蛋白提取率、總蛋白提取率及干重的比較Table 2 Comparison of ferritin extraction yield，protein extraction yield and dry weight under different buffers

由表2 可知，KH2PO4-NaOH 緩沖液組鐵蛋白提取率高于Tris-HCl 緩沖液組鐵蛋白提取率，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。KH2PO4-NaOH 緩沖液組總蛋白提取率低于Tris-HCl 緩沖液組總蛋白提取率，組間存在顯著性差異(P ＜0.05)。KH2PO4-NaOH 緩沖液組干重均值0.1337 g 低于Tris-HCl 緩沖液組干重均值0.1761 g，組間存在顯著性差異(P＜0.05)。

KH2PO4-NaOH 緩沖液組在鐵含量檢測中高于Tris-HCl 緩沖液組，且在總蛋白提取率及物質(zhì)干重方面低于Tris-HCl 緩沖液組，說明KH2PO4-NaOH 緩沖液利于鐵蛋白的富集，且所含雜蛋白少，純度高，故選擇KH2PO4-NaOH 緩沖液作為鷹嘴豆鐵蛋白提取的緩沖液。

2.2.2 緩沖液pH 值的篩選

在KH2PO4-NaOH 緩沖液，50 mmol/L 的MgCl2鹽析，料液比1∶2 提取條件下，緩沖液pH 值對鷹嘴豆鐵蛋白提取的影響結(jié)果如表3 所示。

以鐵蛋白提取率為指標(biāo)，當(dāng)緩沖液pH 為7.5時，與pH 為7.0、8.0、8.5、9.0 組比較，均存在顯著性差異(P ＜0.05)，且緩沖液pH 為7.5 時鐵蛋白提取率存在最大值。以總蛋白提取率為指標(biāo)，緩沖液pH 7.5 組與pH 7.0 組、9.0 組存在顯著性差異(P＜0.05)，其余各組間無統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)緩沖液pH為7.5 時總蛋白提取率存在最大值。以干重為指標(biāo)，緩沖液pH 7.5 組與pH 7.0 組、8.5 組、9.0 組存在顯著性差異(P ＜0.05)，其余各組間無統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)緩沖液pH 為7.5 時物質(zhì)干重存在最大值。

表3 不同pH 值下鐵蛋白提取率、總蛋白提取率及干重的比較Table 3 Comparison of ferritin extraction yield，protein extraction yield and dry weight under different pH

由表3 可知，緩沖液pH 值對鷹嘴豆鐵蛋白提取有顯著影響。當(dāng)緩沖液pH 為7.5 時，鷹嘴豆鐵蛋白提取率存在最大值，且與其余組存在顯著性差異，當(dāng)pH 繼續(xù)升高，一方面降低鐵蛋白含量，另一方面會降低鐵蛋白食用價值［10］。故pH 7.5 為鷹嘴豆鐵蛋白提取緩沖液pH 最適值。

2.2.3 鹽析鹽種類的篩選

在pH 7.5 的KH2PO4-NaOH 緩沖液，料液比1∶2 提取條件下，鹽種類對鷹嘴豆鐵蛋白提取的影響結(jié)果如表4 所示。

表4 不同鹽種類下鐵蛋白提取率、總蛋白提取率及干重的比較Table 4 Comparison of ferritin extraction yield，protein extraction yield and dry weight under different salt

50 mmol/L 的MgCl2鹽析組鐵蛋白提取率高于飽和度為15%～20%的(NH4)2SO4鹽析組，組間存在極顯著性差異(P ＜0.01)。50 mmol/L 的MgCl2鹽析組總蛋白提取率高于飽和度為15%～20%的(NH4)2SO4鹽析組，組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。50 mmol/L 的MgCl2鹽析組物質(zhì)干重高于加飽和度為15%～20%的(NH4)2SO4鹽析組物質(zhì)干重，組間存在極顯著性差異(P ＜0.05)。

在鷹嘴豆鐵蛋白分離純化過程中，加入MgCl2先析出淀粉，再析出鐵蛋白，可以通過離心去除部分淀粉［7］。實驗數(shù)據(jù)表明，MgCl2可特異的從鷹嘴豆種子提取液中鹽析出鐵蛋白，且鹽析效果顯著優(yōu)于(NH4)2SO4鹽析，與文獻［2］報道一致，故選取MgCl2鹽析。

2.2.4 鹽濃度的篩選

在pH 7.5 的KH2PO4-NaOH 緩沖液，MgCl2鹽析，料液比1∶2 提取條件下，鹽濃度對鷹嘴豆鐵蛋白提取的影響結(jié)果如表5 所示。

表5 不同鹽濃度下鐵蛋白提取率、總蛋白提取率及干重的比較Table 5 Comparison of ferritin extraction yield，protein extraction yield and dry weight under different salt concentration

由表5 可知，當(dāng)鹽濃度在10～60 mmol/L 變化時，隨著鹽濃度的增加，鐵蛋白提取率增大。但當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時，鐵蛋白提取率下降。60 mmol/L時存在最大值。當(dāng)鹽濃度在10～70 mmol/L 變化時，隨著鹽濃度的增加，總蛋白提取率、干重增大。但當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時，總蛋白提取率及干重均下降。70 mmol/L 時總蛋白提取率最高為2.436%，干重最高為0.5913 g。當(dāng)鹽濃度為60 mmol/L 時，鐵濃度存在最大值，且雜蛋白含量低于70 mmol/L，利于鐵蛋白的富集，故選取60 mmol/L 為MgCl2鹽析濃度。

2.2.5 料液比的篩選

在pH 7.5 的KH2PO4-NaOH 緩沖液，50 mmol/L的MgCl2鹽析提取條件下，料液比對鷹嘴豆鐵蛋白提取的影響結(jié)果如表6 所示。

表6 不同料液比下鐵蛋白提取率、總蛋白提取率及干重的比較Table 6 Comparison of ferritin extraction yield，protein extraction yield and dry weight under different solid-liquid ratio

實驗數(shù)據(jù)表明，隨著料液比的增大，所得鷹嘴豆鐵蛋白提取率、總蛋白提取率、物質(zhì)干重均逐步增加，且趨于平臺區(qū)。因為適當(dāng)增大料液比，有利于蛋白質(zhì)的溶出，從而使鐵蛋白含量增加。但料液比過大會使鐵蛋白濃度降低，且增加后續(xù)工藝中提取液的濃縮成本。故選取1∶4 為最佳料液比。

2.3 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以鷹嘴豆種子中鐵蛋白提取率、總蛋白提取率、干重為考察指標(biāo)，進行L9(34)正交實驗，實驗結(jié)果見下表。

表7 -1 L9(34)正交實驗設(shè)計及鐵蛋白提取率結(jié)果Table 7 -1 L9(34)orthogonal array design and results of ferritin extraction yields

表7 -2 L9(34)正交實驗鐵蛋白提取率方差表Table 7 -2 Analysis of variance for ferritin extraction yield with different extraction conditions

由表7-1 極差分析可知，以鐵蛋白提取率為指標(biāo)，影響鷹嘴豆鐵蛋白提取工藝因素的主次順序為料液比＞鹽濃度＞溫度＞pH，經(jīng)方差分析，料液比對鷹嘴豆鐵蛋白的提取有顯著影響。最佳提取工藝條件為A2B3C3D1，即緩沖液pH 7.5，70 mmol/L 氯化鎂鹽析，料液比1∶4，溫度50 ℃提取。

表8 -1 L9(34)正交實驗設(shè)計及總蛋白提取率結(jié)果Table 8 -1 L9(34)orthogonal array design and results of protein extraction yield

表8 -2 L9(34)正交實驗總蛋白提取率方差表Table 8 -2 Analysis of variance for protein extraction yield with different extraction conditions

由表8-1 極差分析可知，以總蛋白提取率為指標(biāo)，影響鷹嘴豆鐵蛋白提取工藝因素主次順序為料液比＞pH ＞鹽濃度＞溫度，經(jīng)方差分析，pH、鹽濃度、料液比對鷹嘴豆鐵蛋白提取有顯著性影響。最佳提取工藝為A3B1C3D2，即緩沖液pH 8.0，50 mmol/L 氯化鎂鹽析，料液比1∶4，溫度55 ℃提取。

表9 -1 L9(34)正交實驗設(shè)計及干重結(jié)果Table 9 -1 L9(34)orthogonal array design and results of dry weight

表9 -2 L9(34)正交實驗干重方差表Table 9 -2 Analysis of variance for dry weight with different extraction conditions

由表9-1 極差可知，以干重為指標(biāo)，影響鷹嘴豆鐵蛋白提取工藝因素主次順序為溫度＞料液比＞鹽濃度＞pH。最佳提取工藝為A2B1C3D2，即緩沖液pH 7.5，50 mmol/L 氯化鎂鹽析，料液比1∶4，溫度55 ℃提取。

綜合鷹嘴豆鐵蛋白提取正交實驗結(jié)果的極差分析、方差分析，以鐵蛋白提取率、總蛋白提取率、干重為評價指標(biāo)，最終確定提取工藝條件為A2B3C3D1，即緩沖液pH 7.5，70 mmol/L 氯化鎂鹽析，料液比1∶4，溫度50 ℃提取，可使鐵蛋白濃度最大化時，盡可能降低雜蛋白、淀粉、糖等物質(zhì)含量。

2.4 驗證實驗

用上述確定的最佳提取工藝條件進行3 次平行實驗，鷹嘴豆鐵蛋白提取率為0.002643%，說明所選取的工藝穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究以干燥鷹嘴豆種子為原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進行L9(34)正交實驗確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為，pH 7.5 的KH2PO4-NaOH 緩沖液，濃度70 mmol/L 的MgCl2鹽析，料液比1∶4，作用溫度50 ℃。本工藝具有操作簡單、提取效果好、成本低等優(yōu)點，可為工業(yè)化鷹嘴豆鐵蛋白的提取提供一定理論依據(jù)。

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