劉 穎，魏希穎

陜西師范大學生命科學學院應用微生物學實驗室，西安 710119

內(nèi)生菌對植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化是內(nèi)生菌利用其胞內(nèi)或胞外的一些酶或特定化學物質(zhì)將植物體產(chǎn)生的一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)的過程［1］。此轉(zhuǎn)化可用于獲得新的活性成分和提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量［2］。由于野生藥用植物資源短缺，有些產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不利于人體吸收或毒副作用大等，因此提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物的含量，開發(fā)新的藥用活性成分至關重要。目前用于提高植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量的方法有多種，例如篩選高產(chǎn)細胞系、使用生物或非生物誘導子、植物組織培養(yǎng)等［3］?？紤]到植物生長周期長、受環(huán)影響大，而內(nèi)生菌用于促進藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累以及產(chǎn)生新的活性成分具有繁殖快、生物量大、可塑性強，且轉(zhuǎn)化反應專一有效、條件溫和，操作簡單、產(chǎn)物收效率高等特點，成為當前醫(yī)學和生物學領域研究的熱點。本文主要從內(nèi)生菌對植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以獲得新的活性成分和提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量兩方面進行綜述。

1 獲得新的活性成分

內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化體系可以利用內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物和植物中的某些物質(zhì)反應產(chǎn)生新的化合物或利用植物體內(nèi)的有效成分為前體物質(zhì)，經(jīng)內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生新的活性成分［4］。通過內(nèi)生菌對藥用植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，可以產(chǎn)生一些新的化合物，這為新藥研發(fā)提供了新思路。

彭清忠等［5］從姜黃根莖中篩選到一株能轉(zhuǎn)化姜黃素的內(nèi)生真菌。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為去甲基姜黃素和二去甲基姜黃素。去甲基姜黃素的抗氧化、抗炎癥的活性比姜黃素高。Denise Z.L.Bastos 等［6］利用內(nèi)生菌炭疽菌對白樺脂酸氧化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了樺木酮酸，而這種氧化反應與白樺脂酸和樺木酮酸在哺乳動物體內(nèi)的代謝途徑相似，這為研究藥物代謝途徑提供了新思路。付少彬等［7］從藥用植物蛇足石杉的莖和葉中篩選出了能轉(zhuǎn)化烏蘇酸的4 株內(nèi)生菌，豐富了烏蘇酸的構(gòu)型。任娜［8］采用超高效液相色譜和GCMS 技術，研究了紅豆杉內(nèi)生真菌對艾葉油的生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了新的萜類物質(zhì)。Keyller Bastos Borges等［9］發(fā)現(xiàn)了Phomopsis sp.，Glomerella cingulata，Diaporthe phaseolorum，Aspergillus fumigatus(VR12)四種內(nèi)生真菌對硫醚嗪進行立體選擇性轉(zhuǎn)化的效果顯著。

2 內(nèi)生菌提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量

內(nèi)生菌不僅可以自身合成代謝產(chǎn)物，而且可以誘導宿主植物次生代謝產(chǎn)物的合成，提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量。內(nèi)生菌可以利用植物體內(nèi)活性成分的結(jié)構(gòu)類似物為前體，將其轉(zhuǎn)化為已有的活性成分［2］。

2.1 影響植物次生代謝產(chǎn)物含量的因素

2.1.1 內(nèi)生菌組分對植物次生代謝產(chǎn)物的影響

內(nèi)生菌常被分為菌液濃縮物或提取物、菌絲提取物、菌絲細胞壁降解成分、肽類、蛋白質(zhì)和糖類等不同組分［10］。內(nèi)生菌的不同組分含有的誘導成分及含量不同，對宿主的誘導作用亦會有差別。張瑞芬等［11］用內(nèi)生菌尖孢鐮刀菌Dzf17 的滅活菌絲誘導盾葉薯蕷無菌苗和培養(yǎng)細胞，皂苷元產(chǎn)量比對照組提高了2.865 倍和2.013 倍。用菌液濃縮物誘導盾葉薯蕷無菌苗和培養(yǎng)細胞后皂苷元產(chǎn)量比對照組提高了1.522 倍和1.757 倍。Peiqin Li 等［12］從內(nèi)生菌絲多糖中提取的寡糖DP4，DP7 和DP10 對盾葉薯蕷細胞中薯蕷皂苷元含量影響各不相同。Vinod Kumar 等［13］比較了印度梨形孢的兩種狀態(tài)的菌液提取物對亞麻植物的PT、6-MPT 含量影響。發(fā)現(xiàn)將3%的兩種菌液提取物分別添加到植物毛狀根懸浮細胞中培養(yǎng)48 h 后，添加過濾滅菌的菌液提取物使足葉草毒素、6-甲氧基足葉草毒素含量達到233.8、131.9 mg/L，分別比原來提高了3.8 倍和4.4 倍。而添加高壓滅菌的菌液提取物，足葉草毒素、6-甲氧基足葉草毒素的含量達到149.3、77.5 mg/L。Kiran D.Pawar 等［14］將兩種內(nèi)生真菌黑孢霉和莖點霉菌的菌液提取物和菌絲粉末與來自植物葉和莖的愈傷組織共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)對4 種代謝物含量影響不同。王劍文等［15］用不同的方法提取內(nèi)生真菌細胞壁物質(zhì)，結(jié)果4 種制備方法所得到的誘導子誘導黃花蒿發(fā)根中青蒿素積累的作用不同，其中利用脫脂脫蛋白酸解法提取的誘導子可以最大程度地促進青蒿素的合成。

2.1.2 內(nèi)生菌的添加量對植物次生代謝產(chǎn)物的影響

內(nèi)生菌誘導子的誘導效果因其添加量不同而表現(xiàn)出一定的差異。真菌誘導子的濃度與產(chǎn)物積累有反應飽和型和最適濃度型，在藥用植物細胞誘導培養(yǎng)中主要是最適濃度型［16］。次生代謝產(chǎn)物的積累隨著內(nèi)生菌誘導子濃度的增加而增加或?qū)φT導子有最適濃度要求。

Archana Prasad 等［17］研究了不同濃度(0.5%、1.0%、1.5%)的尖孢鐮刀菌的菌絲提取物與30 天的植物腋芽組織培養(yǎng)體系共培養(yǎng)后，0.5%的誘導子使積雪草苷的積累量(0.94 mg/g)比對照組(0.44 mg/g)增加了2 倍多，1，0%和1.5%的誘導子使體系中積雪草苷的含量僅達到0.33mg/g 和0.18 mg/g。王劍文等［15］研究了不同濃度內(nèi)生真菌誘導子加入培養(yǎng)20 d 的黃花蒿發(fā)根中，當誘導子濃度為0.4 mg/mL 時，青蒿素含量達到最高(9.26 mg/L)。Tao JH 等［18］研究了不同濃度的內(nèi)生真菌Rhizoctonia SP1.誘導子與茅蒼術懸浮細胞共培養(yǎng)9 d 后，對蒼木素含量影響。當加入40 mg/L 的誘導子時，蒼木素的含量達到最大(28.06 μg/L)，比對照組提高了48.3%。Gangping Hao 等［19］發(fā)現(xiàn)不同濃度的內(nèi)生真菌Sphaeropsis sp B301 誘導子(25、50、75、100 μg glc eguiv/mL)和8 d 的銀杏細胞懸浮液共培養(yǎng)4天，當添加了75 μg glc eguiv/mL 的誘導子時黃酮類的含量最高，比對照組提高了1.8 倍。

2.1.3 內(nèi)生菌與植物共培養(yǎng)時間對植物次生代謝產(chǎn)物積累的影響

內(nèi)生菌與植物共培養(yǎng)時間不同，植物次生代謝產(chǎn)物的積累表現(xiàn)出一定的差異。

Yu Wang 等［20］研究了內(nèi)生真菌AL12 菌絲誘導子對藥用植物蒼術中蒼術酮含量的影響。誘導子與蒼術共培養(yǎng)50 d，隨著共培養(yǎng)時間的延長，蒼術酮的積累量逐漸增多，第50 d 達到26.28 μg/g，比對照組增加了4 倍多。Marco Mucciarelli 等［21］把內(nèi)生真菌PGP-HSF 與薄荷葉和根共培養(yǎng)，隨著共培養(yǎng)時間的不同，揮發(fā)性物質(zhì)含量有明顯變化。在內(nèi)生菌-薄荷根共培養(yǎng)28 d 時，乙酸甲酯的含量比14、21、35 d的高。石岳香等［22］研究了隨著內(nèi)生真菌與植物懸浮細胞共培養(yǎng)時間的延長，懸浮細胞內(nèi)生物堿的含量不斷的變化，在前十天比較低，但培養(yǎng)到第四十天，生物堿含量達到最大。Li YC 等［23］研究發(fā)現(xiàn)Taxus chinensis var.Mairei 細胞培養(yǎng)液和內(nèi)生菌Fusarium mairei 共培養(yǎng)10 d 時紫杉醇的含量比共培養(yǎng)5 d 和15 d 的高。

2.1.4 內(nèi)生菌對植物不同組織、器官中次生代謝產(chǎn)物的影響

內(nèi)生菌對植物不同組織、器官中次生代謝產(chǎn)物含量影響不同。內(nèi)生菌作用于植物的不同組織、器官，會引起合成相應次生代謝產(chǎn)物的關鍵基因表達強度和速度不同。

Jisha Satheesan 等［24］將內(nèi)生真菌印度梨形孢和藥用植物積雪草共培養(yǎng)，檢測積雪草苷含量在葉片和整個植株中都有所增加，比對照組增加了2 倍，而在根中沒有明顯增加。通過Real-time PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)合成積雪草苷的關鍵基因SQS 在植物體內(nèi)高水平表達，而BAS 基因在根部低水平表達。Kiran D·Pawar 等［14］把培養(yǎng)相同時間植物葉和莖的愈傷組織分別與40 mg 的內(nèi)生菌莖點霉菌的菌絲粉末共培養(yǎng)，次生代謝產(chǎn)物紅厚殼素A 的含量在葉的愈傷組織中比對照組提高了751 倍，而在莖的愈傷組織中比對照組提高僅364 倍。

2.1.5 內(nèi)生菌對植物不同生長階段的次生代謝產(chǎn)物的影響

植物生長到一定階段后，內(nèi)生菌才可能引起相應代謝物的積累。只有處于生長期的植物細胞才能接受誘導子信號，此時誘導子表現(xiàn)出最強的誘導活性［16］。

Anita K·Brock 等［25］將內(nèi)生菌(Enterobacter radicincitans DSM 16656)與培養(yǎng)了7 周和10 周的擬南芥葉片組織共培養(yǎng)一定時間。脂肪族芥子油苷在7 周的葉片組織中的含量比對照組中的含量低，而在第10 周的葉片組織中，脂肪族芥子油苷的含量又比對照組高。

2.2 內(nèi)生菌對植物次生代謝產(chǎn)物含量產(chǎn)生影響的機理

內(nèi)生菌會對植物次生代謝產(chǎn)物含量產(chǎn)生影響可能有以下原因:一是內(nèi)生菌在宿主細胞中影響宿主光合作用有關物質(zhì)的積累，這些物質(zhì)會增加植物營養(yǎng)的攝入，有助于植物次生代謝產(chǎn)物的合成。二是內(nèi)生菌通過自身的信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)植物細胞合成次生代謝產(chǎn)物相關的基因，改變這些基因的表達速度和強度，誘導植物體內(nèi)相應的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累［26，27］。Gao FK 等［28］研究了信號轉(zhuǎn)導對植物次生代謝產(chǎn)物積累的影響。當一種內(nèi)生菌誘導子加入植物懸浮細胞中，內(nèi)生菌誘導子能促進一些信號分子(NO、水楊酸、活性氧)的合成，植物的一些次生代謝產(chǎn)物的含量隨著增加。由此推斷這些信號分子會促進這些次生代謝物的積累。三是內(nèi)生菌與宿主之間存在化合物或遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。Marco Mucciarelli 等［21］比較了從內(nèi)生菌(PGP-HSF)-薄荷根共培養(yǎng)(1)、沒有感染PGP-HSF 的薄荷(2)、從PGPHSF-薄荷根共培養(yǎng)中分離的PGP-HSF(3)三種體系中胡薄荷酮的含量，發(fā)現(xiàn)胡薄荷酮同時為(1)與(3)中的主要成分，而在(2)中不含胡薄荷酮。可推斷胡薄荷酮可能是通過根部轉(zhuǎn)移到PGP-HSF 中。四是內(nèi)生菌可以合成宿主所不能合成或合成量低的化合物，以此改變宿主代謝產(chǎn)物合成的途徑，進而影響代謝產(chǎn)物的含量［29］。

內(nèi)生菌通過對植物次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為人類提供了豐富的藥用資源。這些次生代謝產(chǎn)物的合成同時有助于激活植物的防御代謝途徑，對植物起保護作用。內(nèi)生菌對植物次生代謝產(chǎn)物影響的各種因素相互聯(lián)系、相互影響，某一因素發(fā)生變化，都可能引起次生產(chǎn)物含量的增加或減少。

3 存在問題

近年來，關于內(nèi)生菌對植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化成為研究的熱點，但此方面研究的廣度、深度均不夠。(1)關于內(nèi)生菌對植物的轉(zhuǎn)化是內(nèi)生菌利用植物體內(nèi)的前體物質(zhì)，經(jīng)過代謝產(chǎn)生新型化合物或提高已有活性成分含量，還是內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物與植物中的一些物質(zhì)發(fā)生反應形成新的化合物或提高已有活性成分含量的機理研究尚淺;(2)目前研究報道很少涉及內(nèi)生菌與植物相互作用時，與次生代謝產(chǎn)物合成和轉(zhuǎn)化的相關基因表達的研究;(3)大多數(shù)研究僅針對一種內(nèi)生菌作用于一種植物，很少涉及多種內(nèi)生菌同時作用于一種植物，對多種菌的協(xié)同作用重視不夠。

4 展望

目前，內(nèi)生菌對植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的研究還處于初級階段。今后可以在以下方面進行深入的研究:(1)轉(zhuǎn)化機理的研究:從細胞水平上，研究信號分子對內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化過程的影響;通過分析合成目標代謝產(chǎn)物的關鍵基因，從分子水平分析關鍵基因的表達強度，利用基因重組對次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(2)多種內(nèi)生菌協(xié)同作用的研究，達到藥用植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最大化。(3)內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化過程的優(yōu)化和放大目前內(nèi)生菌對藥用植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化還處于實驗室階段，反應過程的優(yōu)化和放大，使生產(chǎn)具有可行性和高效性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術支持。

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