周笑犁，連國琦，孔祥峰，3*，王升平，印遇龍

1中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，長沙 410125;2 南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330047;3 中國科學(xué)院環(huán)江喀斯特農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站，環(huán)江 547100

新生仔豬的腸道菌群發(fā)育快速并趨于穩(wěn)定，但斷奶極易破壞腸道微生態(tài)平衡，使病原菌大量繁殖，引起仔豬的腹瀉、生長不良、消化功能紊亂和免疫力下降等［1］。大量研究表明，外源補充精氨酸能調(diào)節(jié)機體氨基酸的吸收和代謝，并促進(jìn)其腸道發(fā)育和功能［2］，增強腸道健康，從而提高機體免疫力［3］，上述作用可能與其對腸道微生物的調(diào)控有關(guān)［4］。但是，外源性精氨酸在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用一直受到價格因素的制約。因此，通過調(diào)控內(nèi)源性精氨酸的合成增加機體內(nèi)精氨酸的供給是一種經(jīng)濟(jì)、有效的策略。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作為尿素循環(huán)中鳥氨酸生成瓜氨酸的中間體N-乙酰谷氨酸的類似物，可有效激活內(nèi)源性精氨酸的合成［2］。在飼料中添加NCG可顯著提高平均日增重、降低料重比，增強機體免疫力，提高背最長肌、腓腸肌和十二指腸蛋白質(zhì)的合成率［5］;在日糧中添加0.1%NCG 可促進(jìn)環(huán)江香豬腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善機體氨基酸平衡和蛋白質(zhì)代謝，提高生長性能和飼料報酬［6］?？梢?，在日糧中添加適量NCG 對提高機體的營養(yǎng)狀況、降低生產(chǎn)成本具有重要現(xiàn)實意義。日糧中添加NCG 是否通過調(diào)控腸道微生態(tài)而對斷奶仔豬發(fā)揮上述有益作用，目前尚未見相關(guān)報道。本研究觀察了日糧中添加NCG 對斷奶環(huán)江香豬腸道微生物區(qū)系的影響，為闡明NCG 的促生長機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用體重為3.17 ±0.21 kg 的21 日齡斷奶環(huán)江香豬12 頭，隨機分為2 組，每組6 頭，單欄飼養(yǎng)。按中國地方豬營養(yǎng)需要量并結(jié)合NRC(1998)營養(yǎng)需要量配制本試驗基礎(chǔ)日糧［7］。試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加0.1%的NCG(含量50%)，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧。日糧中加入2 倍水后，調(diào)成粥狀飼喂。每日飼喂3 次，自由采食和飲水。預(yù)飼3 d 后，逐頭稱取空腹體重。因斷奶后14 d 斷奶應(yīng)激基本消失，故本試驗試驗期為14 d。

1.2 腸道內(nèi)容物采集與微生物DNA 提取

試驗結(jié)束后放血處死仔豬，無菌采集回腸和盲腸內(nèi)容物，提取總細(xì)菌［1］。將提取的細(xì)菌于-70 ℃保存。按試劑盒說明提取細(xì)菌基因組總DNA(TIANGEN 公司)，采用NanoDrop?ND1000(Nano-Drop Technologies Inc.，DE，USA)測定DNA 濃度，并以O(shè)D260/280 評價DNA 純度。

1.3 腸道微生物T-RFLP 分析

PCR 擴增l6S rRNA 全長，以獲得微生物總DNA 作為模板。用6-羧基熒光標(biāo)記的細(xì)菌通用引物8F 5’-6-FAM-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和1492R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’擴增。50 μL 的擴增體系中包括2.5 ng DNA 模板，5 μL 10 ×LA PCR buffer II(含Mg2+)，8 μL 2.5 mM dNTP mixture，20 μM 引物，0.5 μL 5 U/μL LA Taq(TaKaRa，Japan)。PCR 反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃，5 min;95 ℃60 s，56 ℃60 s，72 ℃90 s，30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。取1.0 μg 擴增反應(yīng)產(chǎn)物，分別加入12 U 限制性內(nèi)切酶Hae III(TaKaRa，Japan)及相應(yīng)緩沖液和超純水，使反應(yīng)體系為20 μL，37 ℃過夜溫育。ABI3100 毛細(xì)管電泳自動序列分析儀(PE Biosystems，Warrington，UK)分析熒光標(biāo)記的末端限制性片段(TRF)，此步驟交由上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.4 腸道微生物PCR-DGGE 分析

根據(jù)Walter 等［8］提供的細(xì)菌通用引物，對DNA樣品中的16S rRNA 基因V2～V3 段進(jìn)行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系的配置、擴增程序和反應(yīng)條件均參照Yin 等［1］的報道。采用BioRad DGGE 試劑盒對PCR 擴增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE 分析。電泳采用Dcode DGGE 系統(tǒng)(Bio Rad)，電泳緩沖液為1 ×TAE 緩沖液，在100 V 電壓下60 ℃電泳16 h，采用Molecular Analyst(Bio Rad)對DGGE 凝膠進(jìn)行相似性分析。

1.5 腸道微生物熒光定量PCR 分析

采用SYBR Green I 染料法，在RT-PCR 儀(ABI7 900HT)上進(jìn)行擴增，并運用Applied Biosystem SDS 2.3 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。10 μL 反應(yīng)體系包括:5 μL 2 ×SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa，Japan)，0.2 μL ROX(TaKaRa，Japan)，0.2 μL 10 μM上、下游引物(表1)，2 μL DNA 模板，ddH2O 補充至10 μL。PCR 反應(yīng)程序為:95 ℃，30 s;95 ℃5 s、60℃30 s，40 個循環(huán)?；?6S rRNA 基因相對定量分析樣品中的雙歧桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌、大腸埃希菌和總細(xì)菌，采用2-△△CT法［9］統(tǒng)計目的基因的表達(dá)量，即以總細(xì)菌為內(nèi)參，待測細(xì)菌表達(dá)量(以-△△CT 表示)=(CT，Target-CT，總細(xì)菌)試驗組-(CT，Target-CT，總細(xì)菌)對照組。

表1 腸道部分微生物引物參數(shù)Table 1 Parameters of primer for several intestinal microflora

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和t 檢驗。P ＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCG 對腸道微生物多樣性的影響

由表2 可見，回腸和盲腸內(nèi)容物中微生物的TRF 數(shù)變化顯著;與對照組相比，0.1%NCG 組回腸內(nèi)容物微生物的TRF 數(shù)增加，提示腸道微生物的多樣性提高。

表2 日糧添加NCG 對腸道微生物酶切末端限制性片段的影響(%;n=6)Table 2 Effects of diet supplemented with NCG on intestinal microflora TRFs(%;n=6)

圖1 日糧添加NCG 后回腸內(nèi)容物微生物16S rRNA 的DGGE 圖譜(a)、相似性分析(b)和電泳條帶示意圖(c)Fig.1 DGGE profiles(a)，similarity index(b)and sketch map(c)of 16S rRNA obtained from intestinal microflora in ileum contents after dietary supplementation with NCG

圖2 日糧添加NCG 后盲腸內(nèi)容物微生物16S rRNA 的DGGE 圖譜(a)、相似性分析(b)和電泳條帶示意圖(c)Fig.2 DGGE profiles(a)，similarity index(b)and sketch map(c)of 16S rRNA obtained from intestinal micro flora in cecum contents after dietary supplementation with NCG

由圖1a 和圖1c 可見，NCG 組回腸內(nèi)容物中微生物DGGE 條帶數(shù)(14.7 ±1.6)較對照組(12.2 ±1.0)有增加趨勢，說明日糧添加NCG 可增加試豬回腸微生物菌群的多樣性;由圖2 可見，對照組和NCG 組盲腸內(nèi)容物中微生物區(qū)系的相似性達(dá)60%以上。

2.2 NCG 對腸道部分細(xì)菌數(shù)量的影響

由表3 可見，飼喂0.1%NCG 14 d 后，回腸和盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量顯著增加、大腸埃希菌的數(shù)量顯著降低(P ＜0.05)，盲腸內(nèi)容物中鏈球菌的數(shù)量也顯著降低(P ＜0.05)。

表3 日糧添加NCG 對腸道部分細(xì)菌16S rRNA 的影響(n=6)Table 3 Effects of diet supplemented with NCG on16S rRNA of several intestinal bacteria(n=6)

3 討論

動物消化道內(nèi)棲居著大量微生物，形成復(fù)雜而動態(tài)平衡的微生物區(qū)系，這對宿主的健康和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收起著重要作用。如果微生態(tài)平衡失調(diào)，機體的生理功能就會發(fā)生紊亂，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。腸道中的大多數(shù)微生物為未知的、未被培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的。分子生物學(xué)技術(shù)能有效分析復(fù)雜微生物群落及其多樣性且無須培養(yǎng)微生物，從而越來越受到重視，是近年來用于多種生態(tài)環(huán)境微生物區(qū)系研究的最主要的分子生物學(xué)手段之一。本研究利用T-RFLP、PCR-DGGE 和熒光定量PCR 等技術(shù)研究了日糧添加NCG 對腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)添加后仔豬小腸微生物菌群的多樣性增加。一般認(rèn)為，當(dāng)仔豬腸道微生物多樣性越高時，其穩(wěn)定性也就越好，該系統(tǒng)愈難以因外界因素變化而失調(diào)，而一個穩(wěn)定的腸道微生態(tài)系統(tǒng)無疑對仔豬健康是有利的。最新研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸作為微生物的主要氮源，可提高小腸微生物的多樣性;在微生物分泌酶作用下，精氨酸可被分解成鳥氨酸和瓜氨酸等，進(jìn)而影響機體對氨基酸的利用和代謝［10］。本研究顯示，NCG 可增加仔豬小腸微生物區(qū)系的穩(wěn)定性，這可能是其促進(jìn)機體氨基酸吸收和利用的機制之一［6］。

大腸埃希菌和沙門氏菌是仔豬腸道的正常菌群。仔豬出生后，乳酸桿菌可很快在腸道內(nèi)定殖并成為優(yōu)勢菌;斷奶后，腸道菌群發(fā)生紊亂，大腸埃希菌等致病菌增加，乳酸桿菌等有益菌下降。如果斷奶后腸道中優(yōu)勢菌屬于致病性的大腸埃希菌和鏈球菌屬細(xì)菌，就會引起仔豬腹瀉甚至死亡。本試驗結(jié)果表明，在日糧中添加NCG 可不同程度地抑制回腸和盲腸內(nèi)容物中大腸埃希菌的生長，而提高回腸和盲腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖。由于大腸埃希菌對腸壁的黏附是其發(fā)揮作用的主要條件，推斷乳酸桿菌和雙歧桿菌在腸黏膜上的占位在一定程度上減少了大腸埃希菌的數(shù)量，從而減輕了大腸埃希菌對腸道的不良影響。由于腸道微生物中存在精氨酸酶和精氨酸脫亞胺酶兩條代謝通路，提高了胞外精氨酸家族氨基酸的濃度，從而調(diào)節(jié)精氨酸家族氨基酸在小腸黏膜細(xì)胞的代謝［4，10］，提示NCG 可能作用于微生物中的這兩條代謝通路，促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善機體氨基酸平衡，從而緩解環(huán)江香豬的斷奶應(yīng)激。

綜上所述，日糧添加NCG 可增加斷奶環(huán)江香豬腸道菌群的多樣性，抑制大腸埃希菌、鏈球菌等有害菌的繁殖，促進(jìn)乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的繁殖。

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