張 紅，問慧娟，周雅靜，姜源濤

1河北大學(xué)附屬醫(yī)院;2 河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，保定 071000

應(yīng)激性胃潰瘍是臨床危重疾病的常見并發(fā)癥，在重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)的發(fā)生率可高達(dá)75%～100%，其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但越來越多的研究顯示，氧化應(yīng)激在應(yīng)激胃黏膜損傷中發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)或干擾氧化應(yīng)激以及氧化與抗氧化之間的平衡是胃腸道粘膜細(xì)胞保護(hù)的一個(gè)重要方面。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然抗氧化劑，廣泛存在于21 科31 屬72 種植物中，其中葡萄、虎杖、花生、桑葚等常見植物中含量較高。近年來的研究表明，Res具有清除自由基、抗炎、抑制血小板聚集、舒張血管等多方面藥理學(xué)作用，目前主要應(yīng)用于心血管保護(hù)、衰老、腫瘤預(yù)防等方面。Res 對(duì)應(yīng)激引起的急性胃粘膜損傷的作用尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以大鼠水浸-束縛應(yīng)激(WRS)為模型，探討Res 對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白藜蘆醇(美國Amresco 公司)。NOS 試劑盒、NO 試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測試試劑盒(均由南京建成生物工程研究所提供)。Stat-Fax-2100 酶標(biāo)儀(美國Awareness 公司);TDL-5-A 低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW-80A 型渦旋混勻器(上海滬西分析儀器廠);SHA-BA 型雙功能水浴恒溫振蕩器(金壇市杰瑞爾電器有限公司)。

1.2 模型制作與分組

Wistar 大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)30 只，雌雄各半，體重220～300 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NG)、應(yīng)激組(MG)、白藜蘆醇低劑量組(LDG)、中劑量組(MDG)和高劑量組(HDG)。白藜蘆醇各處理組以白藜蘆醇分別按30、60、120 mg/kg灌胃3 d，NG 組和MG 組灌服同等容量的生理鹽水。末次給藥后，參照Cui 等人［1］的方法建立WRS 模型，8 h 后將動(dòng)物用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，剖腹，游離出胃。

1.3 胃酸測定

抽取胃液，pH 計(jì)測定胃液pH 值。

1.4 胃潰瘍指數(shù)測定

結(jié)扎賁門、幽門端，用10 mL 生理鹽水充灌，置于0.5%福爾馬林溶液中固定5 min，沿胃大彎剪開，漂洗，用濾紙吸干水分，展平，觀察潰瘍形成情況，按改良Guth 標(biāo)準(zhǔn)［1］計(jì)算潰瘍指數(shù):病變的最大徑＜1 mm 為1 分;1～2 mm 為2 分;2～3 mm 為3分;3～4 mm 為4 分;將＞4 mm 者分成若干段，每段按上法計(jì)分，若病灶寬于2 mm，其長度乘以2。全胃各病灶評(píng)分之和作為潰瘍指數(shù)(Ulcer Index，UI)。

1.5 胃組織MDA、SOD 活性測定

留取潰瘍明顯處的胃粘膜組織約0.3 g，加9 倍的生理鹽水，制備成10% 的組織勻漿，4 ℃3000 rpm 離心10 min，取上清液待測。各取50 μL 胃組織勻漿上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。組織蛋白含量用考馬斯亮蘭法測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

正常大鼠胃黏膜表面光滑，未見水腫及出血點(diǎn);WRS 各組大鼠胃腔內(nèi)含大量咖啡樣物質(zhì)，沖洗后可見胃粘膜表面部分脫落，可見廣泛分布、呈條索狀或點(diǎn)狀的深褐色潰瘍面和出血點(diǎn)，潰瘍周圍呈彌漫性水腫，以應(yīng)激組最為明顯;Res 各組胃黏膜水腫、潰瘍面及出血點(diǎn)均有不同程度減輕，以中劑量組作用顯著。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠胃體部的形態(tài)學(xué)圖片F(xiàn)ig.1 Gastric morphologic images of different groups

2.2 胃潰瘍指數(shù)(UI)的變化

與對(duì)照組比較，應(yīng)激組UI 顯著升高(P ＜0.01);與應(yīng)激組比較，Res 各組UI 顯著降低(均P＜0.01)，以中劑量組作用顯著，其中低、高劑量組與中劑量組比具均有顯著差異(均P ＜0.01)，說明Res 可抑制胃潰瘍產(chǎn)生，并具有一定的劑量依賴性;對(duì)照組UI 為0，見表1。

表1 白藜蘆醇對(duì)WRS 模型胃潰瘍指數(shù)、胃液pH、胃組織SOD、MDA 的影響(，n=6)Table 1 Effect of resveratrol on Ulceration Index，pH of gastric juice，SOD and MDA(，n=6)

表1 白藜蘆醇對(duì)WRS 模型胃潰瘍指數(shù)、胃液pH、胃組織SOD、MDA 的影響(，n=6)Table 1 Effect of resveratrol on Ulceration Index，pH of gastric juice，SOD and MDA(，n=6)

注:與對(duì)照組比較，＊＊P ＜0.01;與應(yīng)激組比較，#P ＜0.05，## P ＜0.01;與中劑量組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P ＜0.01;Compare with model，#P ＜0.05，## P ＜0.01;Compare with middle dose Res group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

2.3 胃液pH 的變化

應(yīng)激組大鼠胃液pH 明顯低于對(duì)照組(P ＜0.01)，Res 各處理組均使pH 升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，但各劑量組之間沒有顯著差異，見表1。

2.4 胃粘膜組織SOD、MDA 活性的變化

應(yīng)激組大鼠SOD 活性明顯降低，MDA 含量明顯升高，與對(duì)照組相比改變均有顯著性差異(均P ＜0.01);Res 各組使這些指標(biāo)均發(fā)生了相反變化(P ＜0.05 或P ＜0.01)，以中劑量組作用顯著;其中低劑量組與中劑量組比有顯著差異(P ＜0.05 或P ＜0.01)。見表1。

3 討論

氧自由基通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜破壞，而且可與蛋白質(zhì)巰基或色氨酸殘基反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能或酶活性喪失，引起細(xì)胞廣泛的損傷。超氧陰離子()是生物體內(nèi)最先形成、最主要的氧自由基，可被體內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)及時(shí)清除。氧化和抗氧化平衡失調(diào)是許多疾病發(fā)生、發(fā)展的一種最基本、最普遍的危險(xiǎn)因素。應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前普遍認(rèn)為在應(yīng)激性胃粘膜損傷中氧自由基是一個(gè)早期的、獨(dú)立的致?lián)p傷因素而備受關(guān)注［2］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，應(yīng)激刺激導(dǎo)致MDA 含量明顯升高、SOD 活性顯著降低。因此胃粘膜氧自由基產(chǎn)生和清除失衡是造成胃粘膜的損傷重要機(jī)制之一。

大量的研究發(fā)現(xiàn)許多中草藥表現(xiàn)出了很好的抗?jié)冏饔?，其突出機(jī)制是他們的抗氧化活性或清除活性氧簇(ROS)的能力。Res 是一種天然多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化性。Roghani 等發(fā)現(xiàn)1～100 μmol/L 的Res 能有效抑制細(xì)胞內(nèi)外氧自由基的產(chǎn)生［3］;Leonard 等證實(shí)Res 是一個(gè)有效的羥基、超氧化物和金屬誘導(dǎo)基團(tuán)的清除劑，并對(duì)活性氧引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和DNA 損傷具有保護(hù)作用［4］;Holthoff 也發(fā)現(xiàn)Res 是一種功能性過氧亞硝基陰離子清除劑［5］。本實(shí)驗(yàn)中，Res 預(yù)處理后明顯減輕了WRS 大鼠胃黏膜的水腫、出血和潰瘍面積，潰瘍指數(shù)也顯著降低，顯示出Res 對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍有明確的保護(hù)作用;Res 使胃粘膜組織SOD 的活性顯著升高，MDA 含量降低，提示Res 通過減少氧自由基產(chǎn)生和增加其清除而抑制胃粘膜損傷，發(fā)揮了其抗氧化特性。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)Res 的抗?jié)冏饔靡灾袆┝拷M顯著，低劑量組也顯示出改善胃潰瘍的藥效，但高劑量組作用反而減弱，可能與劑量過大而增加藥物毒性作用有關(guān)，Dey 報(bào)道白藜蘆醇在較高劑量加重潰瘍［6］。

胃酸在應(yīng)激性潰瘍形成中的作用長期以來一直存在爭議，現(xiàn)代普遍認(rèn)為胃酸不是應(yīng)激性潰瘍發(fā)病的主要因素，但是胃酸的存在會(huì)加重胃粘膜損傷，促進(jìn)潰瘍發(fā)生。本研究顯示束縛應(yīng)激引起胃液pH 明顯降低，Res 使胃液pH 升高，在一定程度上防止了胃潰瘍的發(fā)生或加重。Res 提高胃液pH 的機(jī)制目前尚不清楚，賈一韜發(fā)現(xiàn)在束縛應(yīng)激早期即有NFκB 信號(hào)通路的活化［7］，IL-lβ、IL-6 等細(xì)胞因子釋放增加，強(qiáng)烈刺激下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)軸，使胃酸和胃蛋白酶分泌增多［8，9］，Res 可激活SIRT-1，抑制NF-κ 信號(hào)通路，下調(diào)TNF-α、IL-lβ、IL-6 表達(dá)，因而抑制胃酸分泌［10］。有研究發(fā)現(xiàn)NO 是胃酸分泌的內(nèi)源性抑制劑［11］，Res 可提高eNOS 活性，增加NO 合成［12］，因而能抑制胃酸分泌，提高胃液pH。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

中藥的藥物作用通常被認(rèn)為是更安全的傳統(tǒng)療法的替代，Res 通過其強(qiáng)抗氧化活性及抑制胃酸分泌而預(yù)防應(yīng)激性胃粘膜的損傷。因此，Res 有望成為一種新型黏膜保護(hù)劑。

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