史柳芝，史恒芝，黃鎖義，李 容

1右江民族醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，百色 533000;2湖南省郴州市第一人民醫(yī)院，郴州 423000;3右江民族醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，百色 533000

黃酮類(flavontes)化合物是植物光合作用產(chǎn)生的一大類化合物，其藥用價(jià)值很高，具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用［1］。現(xiàn)代研究表明［2，3］，由于氧化損傷的機(jī)制在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，因此，中藥的抗氧化作用是其達(dá)到治療效果的重要因素。很多疾病包括腫瘤、心腦血管疾病、老年癡呆等都不同程度地與自由基損傷有關(guān)。而黃酮類化合物是自然界中抗氧化作用最強(qiáng)的一類天然化合物，由于它具有很強(qiáng)的抑制活性氧、清除自由基作用，同時(shí)毒副作用相對(duì)小于化學(xué)合成藥，因此黃酮類化合物一直是人們致力于尋找新藥的重要研究領(lǐng)域。

雞骨草Abrus cantoniensis，又名廣州相思子、土甘草，為豆科相思子屬植物雞骨革去除莢果后的干燥全草，主要分布于廣東、廣西、福建及海南等地區(qū)。具有清熱解毒，疏肝止痛之功效，是臨床常用中藥，廣泛用于黃疸，脅肋不舒，胃脘脹痛，急、慢性肝炎［4］。雞骨草是治療急、慢性肝炎和肝硬化腹水較為理想的藥材［5］。目前，對(duì)雞骨草黃酮抗氧化研究鮮見報(bào)道，故本文對(duì)雞骨草黃酮體外抗活性氧自由基作用進(jìn)行了研究，旨在為開發(fā)利用雞骨草黃酮資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

1.1.1 原料

新鮮雞骨草，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)教研室覃道光副教授鑒定，樣品標(biāo)本存放在中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室(購(gòu)自廣西百色市右江區(qū)藥店)。

1.1.2 試劑

無(wú)水乙醇，95%乙醇，丙酮，乙醚，苯酚，濃硫酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(J＆KCHEMICAL LTD)。

1.1.3 儀器設(shè)備

KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器(超聲工作頻率40 Hz，昆山市超聲儀器有限公司);722N 型光柵分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司);TG3288.電子天平(上海天平儀器廠);SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);HHsyzL-Ni6-C電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的準(zhǔn)備

2.1.1 樣品提取純化方法

準(zhǔn)確稱取雞骨草10 g，烘干、粉碎。稱取雞骨草粉末約6 g，加80 mL95%乙醇，超聲波提取2.5 h，抽濾。濾渣再加80 mL95%乙醇，超聲波提取2.5 h，抽濾，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至濾液僅剩25 mL 左右為止，放置250 mL 容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，得到雞骨草黃酮提取液。

2.1.2 黃酮的含量測(cè)定

已經(jīng)有文獻(xiàn)雞骨草黃酮進(jìn)行了含量測(cè)定［6］:分別精密吸取黃酮提取液0.5 mL 于10.00 mL 容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min;再加4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，以試劑空白作參比液，于500 nm 處測(cè)吸光度A。，根據(jù)回歸方程:A=13.5184C-0.0311，計(jì)算樣品中總黃酮的含量ρ=0.3063 mg/mL。

2.2 黃酮提取物清除DPPH 自由基能力

DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，提供H 被還原，顏色發(fā)生變化，由深紫色變?yōu)榈S色，可以用紫外可見分光度法定量測(cè)定。取0.5 mL 新配置的DPPH 溶液［c(DPPH)=6 ×10-4mol/L］置于10 mL 的具塞比色管中，然后加入不同體積的樣品溶液，無(wú)水乙醇定容至5 mL，室溫暗光下反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm 處測(cè)定其吸光度A。以高濃度逐漸稀釋的方式檢測(cè)不同濃度樣品對(duì)自由基的清除率，以自由基清除率為50%時(shí)樣品的濃度(IC50)來衡量樣品對(duì)自由基的清除能力。IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強(qiáng)。其清除率計(jì)算公式:

其中A1為反應(yīng)時(shí)間t=0 min 時(shí)空白吸光度，A2為反應(yīng)時(shí)間t=30 min 時(shí)的吸光度。

以實(shí)驗(yàn)提取液總黃酮作為樣品用無(wú)水乙醇定容至5 mL 分別測(cè)其對(duì)DPPH 自由基清除的作用，由圖1 可以看出，隨著黃酮濃度的增加，對(duì)DPPH 的清除作用增大，自由基清除率為50% 時(shí)樣品的濃度(IC50)為0.228 mg/mL，濃度較小，表明雞骨草黃酮清除DPPH 自由基的能力較顯著。

圖1 DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH free radicals clearance

2.3 黃酮提取物清除超氧自由基能力

采用鄰苯三酚自氧化法［7］進(jìn)行測(cè)定。具體方法如下:取0.5 mol/L、pH8.2 的Tris-HCl 緩沖液4.0 mL 于干燥具塞比色管中，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入不同濃度的待測(cè)品0.2 mL，后均加入2.5 mmol/L 鄰苯三酚(由10 mmol/L HCl 制)0.8 mL，混勻后25 ℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即加入10 mmol/L HCl 2 滴終止反應(yīng)，蒸餾水調(diào)零，在320 nm 處測(cè)定吸光度A。其清除率計(jì)算公式:

其中A0:為加鄰苯三酚但不加樣品時(shí)的吸光度;A1:為加樣品和鄰苯三酚時(shí)的吸光度;A2:為加樣品不加鄰苯三酚時(shí)的吸光度。

圖2 超氧自由基清除率Fig.2 The clearance rate of superoxide redical

2.4 還原Fe3+能力

采用普魯士蘭法［7］測(cè)定樣品還原Fe3+能力。在系列10 mL 具塞比色管中依次加入不同濃度的樣品溶液2.5 mL，2.5 mL 磷酸鹽緩沖液［C(磷酸鹽緩沖液)=0.2 mol/L pH6.6］和2.5ml 鐵氰化鉀(1%)，混勻后置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入2.5 mL 三氯乙酸(10%)，混勻后將溶液渾濁離心(3000 rpm)10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL(0.1%)三氯化鐵溶液，混勻，以試劑空白作參比，在700 nm 處測(cè)定吸光度值，吸光度值增加表明還原能力增強(qiáng)。

由表1 可以看出，隨著黃酮濃度增大，其吸光度值增加，對(duì)Fe3+還原能力增強(qiáng)。

表1 還原Fe3+能力吸光度值Table 1 Absorbency value of evident reduction energy

3 結(jié)論

近年來，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)備受青睞，而黃酮類化合物以其光譜的藥理作用引人矚目。雞骨草的來源廣泛，因此，本文的研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究雞骨草的藥理活性及其深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 Zhu D(朱丹)，Yuan F(袁芳)，Meng K(孟坤)，et al.The research progress of flavonoids.China J Tradit Chin Med Pharm(中華中醫(yī)藥雜志)，2007，22:387-389.

2 Arruda SF，Souza EMT，Siqueira EMA.Carotenoids frommalnga(Xanthosom a sagittifolium)leaves protect cells against ox2 idative stress in rats.Int J Vitam Nutri Res，2005，75:161-163.

3 Jagtap UB，Panaskar SN，Bapat VA.Evaluation of antioxidant capacity and phenol content in jackfruit(Artocarpus heterophyllus Lam.)fruit pulp.Plant Foods Hum Nutr，2010，65:102-106.

4 Association of Chinese Medicinal Plant(中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)).Chinese Medicinal Plant(中國(guó)藥典).Beijing:Chemical Industry Publishing House，2005.135.

5 Zhu Q(朱奇)，Chen Y(陳彥).The development device and present studies of biological nitrogen fixation in Chinese agricultural production.J Microbiol(微生物學(xué)雜志)，2003，23:40-43.

6 Zhang LD(張麗丹)，Luo JH(羅建華)，Meng CY(蒙春越)，et al.Extracting total flavone from Abrus cantoniensis and the effect of its extract on scavenging of hydroxyl radicals.Studies of Trace Elements and Health(微量元素與健康研究)，2007，24:44-45.

7 Wen ZJ(溫昭君)，He YP(何燕平)，Wu WL(吳韋柳)，et al.The antioxidant effect of flavonoid of caudexes of Jasminum sam bac.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)藥)，2012，23:1866-1867.