申義君,周金偉,王 斌,李計(jì)尚,沈留紅,余樹民,曹隨忠
四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,雅安 625014
奶牛圍產(chǎn)期和泌乳期機(jī)體代謝旺盛,易出現(xiàn)代謝紊亂、脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)、自由基產(chǎn)生增多、機(jī)體清除自由基的能力減弱,很容易引起體內(nèi)自由基的蓄積,而蓄積在體內(nèi)的自由基致使脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和核酸損傷,促進(jìn)易感牛各種疾病的發(fā)生與發(fā)展,例如免疫力下降、乳房炎、子宮炎[1,2]。增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力,從而提高機(jī)體清除自由基的能力,在一定程度上可提高機(jī)體的免疫應(yīng)答能力和抗病能力。
黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是一種水溶性復(fù)合植物多糖,具有生物活性的多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖六種單糖組成,是黃芪的主要活性成分之一。現(xiàn)代藥理研究證明APS 具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗應(yīng)激、抗氧化、降血糖、抗病毒、防衰老等多種作用[3,4]。關(guān)于APS是否能提高泌乳期奶??寡趸芰陀行Х乐箼C(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化,目前還鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)泌乳奶牛日糧中添加不同劑量的APS 探討APS 對(duì)奶??寡趸芰Φ挠绊懀云跒樘烊豢寡趸瘎┑拈_(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
1.1.1 試驗(yàn)藥物
APS 購(gòu)自愛(ài)迪森(北京)生物科技有限公司(批號(hào):1 208061;純度:每1 g 含黃芪多糖以葡萄糖計(jì)為571 mg,每1 g 黃芪多糖粉相當(dāng)于原生藥7 g),為黃色精細(xì)粉末。
1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物
年齡、胎次和體重相近的健康荷斯坦奶牛35頭,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛養(yǎng)殖基地提供。
1.1.3 儀器與試劑
超純水儀(型號(hào)MILLPAK20,美國(guó)),Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó))??偪寡趸芰?T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒(均購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。
1.2.1 動(dòng)物分組與處理
將35 頭年齡、胎次和體重接近的泌乳期荷斯坦奶牛隨機(jī)分為5 組(每組7 頭),分別為空白對(duì)照組、試驗(yàn)1 組(5 g/頭·d)、試驗(yàn)2 組(10 g/頭·d)、試驗(yàn)3 組(50 g/頭·d)和試驗(yàn)4 組(100 g/頭·d)。在常規(guī)飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上,4 個(gè)試驗(yàn)組分別將5、10、50、100 g 劑量的APS 粉拌入精料飼喂,每天1 次,連續(xù)給藥14 d;空白對(duì)照組按照同樣方法飼喂精料。
1.2.2 飼養(yǎng)管理
各組試驗(yàn)?zāi)膛5娘曫B(yǎng)管理?xiàng)l件相同,在開(kāi)放式固定槽位栓系飼養(yǎng),統(tǒng)一定時(shí)定質(zhì)定量飼喂,自由飲水。
1.2.3 血樣采集
分別于給藥第0、14 和24 d 的上午9:00~10:00 對(duì)所有試驗(yàn)?zāi)膛_M(jìn)行尾根靜脈采血,分離血清,-20 ℃保存待檢。
1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法
采用Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó))以比色法測(cè)定奶牛血清中GSH-PX 活性、SOD活性、MDA 含量以及T-AOC。具體檢測(cè)方法和步驟參照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS19.0 軟件應(yīng)用one-way ANOVA 選擇LSD 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,以P <0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
各添加APS 組在喂藥結(jié)束時(shí)(除5 g 組外)都能不同程度的提高血清中T-AOC 能力,且在停藥后(除100 g 組外)仍繼續(xù)提高。在第14 d 時(shí)100 g 組與空白對(duì)照組比較差異顯著,其他各組與空白對(duì)照組和100 g 組差異不顯著;第24 d 時(shí)5 g 組、10 g組、50 g 組與空白對(duì)照組差異顯著,其中50 g 組與5 g 組、10 g 組相比較差異顯著。100 g 組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總抗氧化能力差異不顯著(表1)。
表1 黃芪多糖對(duì)T-AOC 能力的影響(U/mL)Table 1 Effect of APS on T-AOC of Holstein cows(U/mL)
添加APS 組在喂藥結(jié)束時(shí)(除10 g 組)均能提高奶牛血清中SOD 活性,且在停藥后(除100 g 組外)都仍有不同程度的提高。在第24 d 時(shí)APS 各添加組SOD 活性都顯著高于對(duì)照組。10 g 組、50 g 組SOD 活性在第24 d 時(shí)與第0 d 時(shí)比較差異顯著,而且50 g 組停藥后10 d SOD 的活性較停藥時(shí)有小幅的增加(表2)。
表2 黃芪多糖對(duì)奶牛SOD 活性的影響(U/mL)Table 2 Effect of APS on activity of SOD of Holstein cows(U/mL)
添加APS 組均能提高血清中GSH-Px 活性,停藥后開(kāi)始逐漸降低。第14 d 時(shí)和第24 d 時(shí)各APS添加組GSH-PX 活性(除5 g 組外)均與對(duì)照組差異顯著,且在第14 d 時(shí)50 g 組GSH-PX 的活性提高最大。添加APS 組(除5 g 組外)GSH-PX 活性在第14 d 時(shí)和第24 d 時(shí)與0 d 時(shí)比較,GSH-PX 活性增加均達(dá)到顯著水平(表3)。
表3 黃芪多糖對(duì)GSH-Px 活性的影響(U/mL)Table 3 Effect of APS on activity of GSH-Px of Holstein cows(U/mL)
添加APS 組均能不同程度的降低血清中MDA含量,且停藥后(除100 g 組)開(kāi)始逐漸升高。第14 d 時(shí),不同劑量APS 添加組MDA 含量與空白對(duì)照組比較顯著降低(P <0.05),其中50 g 組MDA 含量下降的幅度最大;第24 d 時(shí)只有100 g 組MDA 的含量與對(duì)照組差異顯著;100 g 組MDA 的含量在第14 d和第24 d 時(shí)都與0 d 時(shí)的含量差異顯著,表明APS能降低血液中MDA 的含量(表4)。
表4 黃芪多糖對(duì)奶牛MDA 含量的影響(nmol/mL)Table 4 Effect of APS on content of MDA of Holstein cows(nmol/mL)
動(dòng)物機(jī)體在正常的代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生含氧的自由基,而機(jī)體的防御系統(tǒng)會(huì)將其及時(shí)清除,維持自由基的代謝平衡,不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。然而一些不利因子會(huì)引起自由基代謝紊亂,加之生物膜中存在大量的不飽和脂肪酸,很容易引起脂質(zhì)過(guò)氧化,破壞生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能,從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[5]。通過(guò)外源性補(bǔ)充抗氧化劑輔助調(diào)整自由基平衡,預(yù)防疾病的發(fā)生是目前的研究新熱點(diǎn)。大量研究表明,包括APS 在內(nèi)的許多植物多糖都具有較強(qiáng)抗氧化作用[5,6],其機(jī)理包括:1)多糖具有很好的還原性,可以直接作用于自由基本身,通過(guò)自身的還原反應(yīng),捕獲氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的活性氧,而保護(hù)生物體內(nèi)的其他還原成分,而發(fā)揮抗氧化作用;2)多糖分子抑制生物氧化過(guò)程中氧化酶的活性,而發(fā)揮抗氧化作用;3)多糖分子通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化酶活性發(fā)揮作用。
動(dòng)物機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)有非酶系統(tǒng)和酶系統(tǒng)這兩個(gè)系統(tǒng),其中酶類抗氧化劑主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等。機(jī)體促進(jìn)或提高O-·2 的消除,可以通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化以及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,提高機(jī)體的抗氧化能力。檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶等體內(nèi)抗氧化酶的活性和丙二醛含量等指標(biāo),可以從整體水平上來(lái)評(píng)價(jià)多糖的抗氧化能力[7]。總抗氧化能力可以直接反應(yīng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性和非酶類抗氧化能力的大小,體現(xiàn)著機(jī)體防御系統(tǒng)的抗氧化能力的強(qiáng)弱,與健康程度存在著密切的聯(lián)系[8]。在添加APS 的第14 d 100 g 組總抗氧化能力提升幅度最大,在停藥后10 d 50 g 組總抗氧化能力提升幅度最大,表明大劑量飼喂APS 能在喂藥期間大幅度的提升總抗氧化能力,其中50 g 劑量飼喂APS 能較長(zhǎng)時(shí)間維持奶牛的總抗氧化能力。
Sordillo 等[9]報(bào)道,抗氧化劑能增強(qiáng)泌乳期奶牛的健康、避免免疫障礙,更有效的避免疾病的發(fā)生。T-SOD、GSH-Px 是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的重要酶系,李睿文等[1]研究證實(shí)隱性乳房炎呈陽(yáng)性奶牛體內(nèi)T-SOD、GSH-Px 活性比隱性乳房炎呈陰性奶牛的要低,隱性乳房炎奶牛體內(nèi)SOD 和GSH-PX 的活性成負(fù)相關(guān)。Malbe 等[10]研究發(fā)現(xiàn)單位血紅蛋白中GSH-Px 活性低于3.3 microkat 時(shí)會(huì)增加奶牛乳腺區(qū)域感染病原菌的機(jī)率。維生素C 和維生素E 是公認(rèn)的抗氧化劑,Weiss[11]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充VC、VE能降低乳房炎的發(fā)生率。本研究顯示在喂藥第14 d和停藥后10 d 各試驗(yàn)組均能提高奶牛血清中SOD、GSH-Px 的活性,其中以10 g 組和50 g 組效果顯著。不同學(xué)者研究表明,APS 能夠提高體內(nèi)T-SOD 和GSH-Px 活性,降低MDA 含量,具有很好的抗氧化作用[6,12]。本研究同樣也表明,奶牛日糧中添加APS能提高奶牛血清中SOD、GSH-Px 的活性,改善體內(nèi)氧化應(yīng)激的狀態(tài)。
MDA 是機(jī)體內(nèi)自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用而形成的一種脂質(zhì)過(guò)氧化物,對(duì)細(xì)胞有嚴(yán)重的毒性作用,可對(duì)線粒體呼吸功能、丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶有抑制作用。機(jī)體中MDA的量常??梢苑从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,間接的反應(yīng)出細(xì)胞損傷的程度。曾安國(guó)等[12]研究了APS 的抗氧化性,結(jié)果表明APS 能降低MDA 含量。本研究結(jié)果顯示,在喂藥結(jié)束當(dāng)天添加APS 各組(除5 g 組外)都能顯著降低奶牛血清中MDA 的含量,且在停藥第10 d 時(shí)100 g 的APS 飼喂量能繼續(xù)降低血清中MDA 的含量,表明APS 能夠降低奶牛血清中MDA 的含量并呈一定的劑量依賴關(guān)系,推測(cè)APS 能減少泌乳奶牛體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,減少氧自由基對(duì)生物膜完整性的破壞。
本研究表明,日糧中添加APS 可提高奶牛的抗氧化能力,改善奶牛體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
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