曹靜亞，遲曉峰，譚 亮，胡風祖*

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810008;2 中國科學院研究生院，北京 100049

糖是植物和動物的主要能源物質［1］，也是人體六大營養(yǎng)素之一，對于人體正常生長發(fā)育起著重要作用。枸杞子(FructusLycii)是茄科植物枸杞的成熟果實，它是我國的傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中具有重要的地位。枸杞子中含有豐富的氨基酸、維生素、活性酶、多酚類、核苷類等活性物質及礦物質。其中，糖類是枸杞子中很重要的一部分，它的種類和含量反映了枸杞子的質量和營養(yǎng)價值。青海柴達木地區(qū)日照時間長，輻射量大，氣溫日差較大，制造有機物質多，其獨特的高原大陸性氣候造就了柴達木枸杞子的優(yōu)良品質。據記載，柴達木地區(qū)栽培枸杞子的年產量約為10～20 噸，野生枸杞子的年產量約為2～10 噸，是一筆寶貴的可利用資源。

國家標準中測定糖的方法有直接滴定法和高效液相-示差折光檢測法。文獻報道的方法有氣相色譜法［2］、連續(xù)流動分析法［3，4］、離子色譜法［5，6］、毛細管電泳法［7］等，但這些方法都存在著一定的不足，如:滴定法耗時太長，且只能測定的是總糖含量;高相液相色譜-示差折光不能進行梯度洗脫［8］;而氣相法需要對糖類化合物進行衍生，比較復雜。超高效液相色譜(UPLC)是目前較先進的液相色譜，具有速度快、效率高、節(jié)約試劑等特點。另外，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)是一種質量型檢測器，基于不揮發(fā)樣品顆粒對光的散射程度與其質量成正比而進行檢測，對沒有紫外吸收、熒光或電活性的物質以及產生末端紫外吸收的物質均能產生響應［9］。ELSD 具有靈敏度高、溶劑與改性劑的兼容性寬泛、梯度洗脫時基線平穩(wěn)等優(yōu)勢，適用于枸杞子中糖類物質的分析。本文采用UPLC-ELSD 法對柴達木栽培和野生枸杞子中水溶性糖含量進行了測定，旨在為青海柴達木枸杞子的開發(fā)利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及主要儀器

實驗中所用的柴達木栽培和野生枸杞子樣品均采自青海省海西州各地區(qū)，經中科院西北高原生物研究所胡風祖研究員鑒定為枸杞子真品。

各標準品鼠李糖(批號:111683-200401)、木糖(批 號:111508-200404)、果 糖(批 號:111504-200001)、葡萄糖(批號:110833-200904)、蔗糖(批號:111507-200302)均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈(色譜純，Merck 公司);超純水(實驗室自制，電阻率≥18.2 MΩ);三乙胺(分析純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司)。

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀(配備有2424 蒸發(fā)光散射檢測器，美國Waters 公司);AG135電子天平(德國Mettler Toledo 公司);KQ-100E 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器科技公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備溶液的制備

取鼠李糖、木糖、果糖、葡糖糖及蔗糖標準品適量，精密稱定，置于25 mL 容量瓶中，加乙腈-水溶液(80:20，v/v)溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質量濃度約為1 mg/mL 的各標準品儲備溶液。置于4℃冰箱中存放，備用。

1.2.2 樣品的處理

枸杞子鮮樣粉碎，勻漿，精密稱定約0.2 g，置于具塞三角瓶中，加入50 mL 乙腈-水溶液(80:20，v/v)密封稱重，在35 ℃條件下，以50 W 功率超聲30 min，用提取溶劑補重，過濾。棄去初濾液，取續(xù)濾液2.0 mL 過預先活化好的固相萃取小柱(小柱活化方式:用3.0 mL 甲醇沖洗，再用6.0 mL 水沖洗)，待液體全部流過小柱后用2.0 mL 水沖洗，萃取液和洗脫液收集到5 mL 容量瓶中，加提取溶劑稀釋至刻度，搖勻。溶液過0.22 μm 微孔濾膜過濾后進樣分析。

1.2.3 UPLC 分析

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Amide 柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm);流動相:乙腈-水溶液(80∶20，v/v，且兩相均含0.2% 三乙胺);流速:0.15 mL/min;柱溫:45 ℃;進樣體積:3 μL;ELSD 條件:漂移管溫度:50 ℃;載氣:氮氣;氣體壓力:40 psi;噴霧器模式:冷卻。標樣色譜圖如圖1(a)所示，樣品色譜圖如圖1(b)所示。

圖1 標準品(a)和樣品(b)的UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of mixture of five sugarstandards(a)and sample(b)

1.2.4 標準曲線的繪制

實驗測得枸杞子樣品中的水溶性糖主要為果糖和葡萄糖，因此分別精密吸取2.5 mL 果糖和葡萄糖標準儲備液于10 mL 容量瓶中，加乙腈-水溶液(80∶20，v/v)稀釋至刻度，搖勻，得果糖和葡萄糖的混標液，其中果糖的濃度為212.5 μg/mL，葡萄糖的濃度為247 μg/mL。分別精密吸取8.00、6.00、4.00、2.00、1.00 和0.50 μL 混標液，按“1.2.3”項下色譜條件測定峰面積。分別以果糖和葡萄糖的進樣量(x)為橫坐標，色譜峰面積l g 值(y)為縱坐標繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 色譜分析條件優(yōu)化

考察了不同比例的乙腈-水溶液作為流動相的色譜分離條件，在此流動相條件下，色譜峰多有拖尾現象，且各色譜峰分離度均不高，分析其原因可能是還原糖的變旋導致峰形變差，出現不必要的α-與β-端基異構體的分離。因此在A、B 流動相中均加入0.2%三乙胺改性劑，在乙腈-水溶液(70∶30，v/v，且兩相均含0.2%三乙胺)作為流動相時，五種糖在5 min 內出峰完畢，但前三種糖沒有達到基線分離。因此，繼續(xù)加大乙腈比例，在乙腈-水溶液(80∶20，v/v)作為流動相時，五種糖均達到基線分離。對于ELSD 檢測器，漂移管溫度和載氣流速是兩個重要參數［10］。選擇漂移管溫度為50 ℃，氮氣作為載氣，氣體壓力為40 psi 時可達到最小的噪聲信號，色譜圖基線平穩(wěn)。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

實驗選擇超聲提取的方法，考察了水、乙腈-水溶液(50∶50，v/v)、乙腈-水溶液(80∶20，v/v)和乙腈萃取溶劑體系的萃取效果。結果發(fā)現水、乙腈-水溶液的萃取效果較好?？紤]到進樣溶劑應該接近流動相的組成，且盡可能低于流動相洗脫能力，所以選擇乙腈-水溶液(80∶20，v/v)作為萃取溶劑。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系

依據“1.2.4”項下標準曲線繪制方法，得果糖的回歸方程為:Y=1.057X+5.506 (R2=0.9983)，進樣質量在0.106～1.700 μg 范圍內線性關系良好;葡萄糖的回歸方程為:Y=0.891X +5.695(R2=0.9991)，進樣質量在0.123～1.976 μg 范圍內線性關系良好。

2.3.2 重復性

取同一枸杞子鮮樣6 份，精密稱定，按“1.2.2”項下方法處理，按“1.2.3”項下色譜條件測定峰面積。結果果糖和葡萄糖峰面積的RSD 分別為3.15%和2.39%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 精密度

精密吸取果糖和葡萄糖對照品溶液3 μL 和一份樣品溶液3 μL 分別進樣6 次，測定各成分的峰面積。結果果糖和葡萄糖對照品的RSD 分別為1.91%和2.03%，樣品中果糖和葡萄糖的RSD 分別為2.67%和2.23%，表明儀器及進樣精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性

取枸杞子供試品溶液一份，室溫放置，分別在0、2、4、8、12 和24 h 時進樣3 μL，分別測定果糖和葡萄糖的峰面積。結果果糖的RSD 為2.36%，葡萄糖的RSD 為1.91%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率

分別稱取已知含量的枸杞子樣品9 份，每份0.1 g，精密稱定，分別精密加入不同濃度水平的混合對照品溶液，進行加標回收實驗。結果果糖和葡萄糖的平均回收率分別為91.8% (RSD=1.66%)和89.6%(RSD=2.55%)。結果見表1。

表1 枸杞子樣品中果糖和葡萄糖的加樣回收率實驗結果(n=9)Table 1 Results of recoveries of fructose and glucose in the FructusLyciifrom Qaidam Basin(n=9)

2.3.6 檢測限和定量限

配制3 個不同濃度水平的果糖和葡萄糖混標溶液，每個水平的標準溶液分析3 次，以3 倍信噪比(S/N=3)條件確定檢測限，以10 倍信噪比(S/N=10)條件確定定量限。結果果糖的檢出限為0.86 μg/mL，定量限為2.17 μg/mL;葡萄糖的檢出限為0.64 μg/mL，定量限為1.68 μg/mL。

2.4 樣品的測定及數據分析

22 個柴達木栽培和野生枸杞子樣品均按“1.2.2”項下方法處理，按“1.2.3”項下色譜條件測定峰面積，結果見表2 和表3。

表2 柴達木栽培枸杞子中水溶性糖含量(n=3)Table 2 Contents of water-soluble sugar in the cultivatedFructusLycii from Qaidam Basin(n=3)

表3 柴達木野生枸杞子中水溶性糖含量(n=3)Table 3 Contents of water-soluble sugar in the wild FructusLycii from Qaidam Basin(n=3)

2.4.1 枸杞子中各單糖含量的比較

由以上兩表看出，柴達木地區(qū)栽培枸杞子中果糖和葡萄糖平均含量均高于野生枸杞子，栽培枸杞子中水溶性糖含量差異的波動遠小于野生枸杞子，其原因可能是由于野生枸杞子本身的品種差異及生長環(huán)境的差異所造成。

2.4.2 枸杞子中水溶性糖總含量的比較

栽培枸杞子中水溶性糖總含量最高在諾木洪地區(qū)(為14.85%)，最低在都蘭縣夏日哈鎮(zhèn)沙珠玉村(為8.69%);野生枸杞子中，尕海鎮(zhèn)陶哈村的野生紅果枸杞子中水溶性糖總含量最高(為22.04%)，諾木洪宗加鎮(zhèn)的野生黃果枸杞子次之(為15.54%)，而柯魯克野生黑果枸杞子中水溶性糖總含量最低(為3%左右)。從枸杞子果實顏色上看，野生黑果枸杞子中水溶性糖總含量最低，紅果枸杞子含量普遍較高。另外，野生黃果枸杞子中葡萄糖含量最高。

綜上，柴達木栽培枸杞子具有很整齊的品質優(yōu)良性，而野生枸杞子因其生長地區(qū)和自身品種不同，品質差異很大，適宜于選擇性的開發(fā)。

3 結論

本研究建立的超高效液相-蒸發(fā)光散射法可同時定量測定枸杞子中的鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖和蔗糖。樣品中加入乙腈-水溶液(80∶20，v/v)超聲提取，經固相萃取小柱凈化后，定容過濾，以ACQUITY UPLC BEH Amide 柱為分析柱，以乙腈-水溶液(80∶20，v/v，且兩相均含0.2 %三乙胺)作為流動相，流速為0.15 mL/min，柱溫為45 ℃，漂移管溫度為50 ℃，N2流量為40 psi 進行檢測。該方法操作簡單、效率高、重現性好、結果準確可靠，適用于枸杞子中水溶性糖含量的測定。

過對青海柴達木栽培和野生枸杞子中水溶性糖含量的比較，發(fā)現栽培枸杞子中果糖和葡萄糖含量整齊度遠優(yōu)于野生枸杞子;而不同地區(qū)、不同品種野生枸杞子中果糖和葡萄糖含量差異很大，這一研究對于柴達木地區(qū)野生枸杞子的選擇性開發(fā)利用提供了一定的理論依據。

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