董愛文，朱春艷，卓 琦

1吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，張家界 427000;2吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首 416000;3 吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院，張家界 427000

五爪龍(Potentilla kleiniana Wight et Arn.)(蛇含委陵菜)是委陵菜屬植物［1］。常以全草入藥，性味:苦，微寒。具有清熱解毒、止咳止痢、截瘧、解毒活血等功效，常用于治療咽喉腫痛、小兒驚風(fēng)、百日咳、急慢性胃炎等療效顯著［2］。武陵山區(qū)中醫(yī)用五爪龍等草藥用適量白酒搗爛后的醇浸液或水煎煮的湯液來(lái)外敷治療瘡毒、痛腫及蛇蟲咬傷等。而兩種外敷液實(shí)際治療效果差異較大，中醫(yī)會(huì)根據(jù)病況選擇性使用何種外敷液及方中君藥五爪龍用量。參考相關(guān)文獻(xiàn)芹菜素具有抗氧化、抑制致癌物活性、抗炎、抗菌、抗病毒、抗焦慮、抗內(nèi)毒素與免疫調(diào)節(jié)劑等作用［3，4］;而槲皮素有抗癌防癌、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗衰老、抗炎、抗過(guò)敏、抗自由基及抗氧化等多種生物活性，且對(duì)人體無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)致死、致癌、致畸、致突變等作用［5，6］，而委陵菜屬植物均含芹菜素、槲皮素等［7］，據(jù)此建立薄層層析分離、HPLC 法測(cè)定此外敷液中芹菜素與槲皮素的含量，并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了考察［8］，結(jié)果表明，此法能迅速、準(zhǔn)確測(cè)定芹菜素與槲皮素在兩外敷藥液中的含量，初步探索了民間藥的有效成分分析與檢測(cè)方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀(日本)島津;R-215 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士)BUCHI;LD5-2A 離心機(jī)(北京醫(yī)用);HH-6 電子恒溫水浴鍋(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司);MHA 型數(shù)顯式恒溫電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

乙醇、磷酸、鹽酸、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、甲酸為國(guó)產(chǎn)分析純，水為蒸餾水，甲醇為色譜純;薄層層析用硅膠(青島海洋化工有限公司);羧甲基纖維素鈉(湘潭市森泰化工);芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，純度≥98 %);槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):100081-200907，中國(guó)藥品生物制品鑒定所)。

五爪龍兩外敷液按張家界市永定區(qū)沙堤鄉(xiāng)汆水溪村田中醫(yī)提供的藥方配制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Shim-pack VP-ODS C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:甲醇-0.4%磷酸(50∶50，v ∶v);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;進(jìn)樣體積:10 μL。檢測(cè)液進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm 濾膜抽濾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取于60 ℃減壓干燥至恒重的芹菜素與槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品各20.00 mg，混合置于100 mL 容量瓶中，乙醇溶解并定容，得兩成分各0.2 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用0.45 μm 濾膜抽濾，即得。

2.3 供試溶液的制備

A 液:按配方稱取陰干水分新鮮五爪龍(15 g)等草藥混合，加入適量50%乙醇搗碎，補(bǔ)充乙醇至500 mL，密封后室溫浸漬8 h，三層脫脂棉紗布過(guò)慮;B 液:按配方稱取陰干水分新鮮五爪龍(15 g)等草藥切碎、混合后加500 mL 蒸餾水，溫火煎煮至沸騰后30 min，趁熱三層脫脂棉紗布過(guò)慮;兩外敷液用4號(hào)新華濾紙抽濾，濾液再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至15～30 mL。濃縮液依次用石油醚，氯仿萃取去雜后各加入25%鹽酸15 mL 水浴回流水解60 min，快速冷卻，離心(10 000 rpm)10 min，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL 左右，經(jīng)硅膠G 薄層層析，刮取與芹菜素、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品相同Rf0.65 與0.53 的全部芹菜素與槲皮素斑點(diǎn)［9］。溶解定容至100 mL，搖勻，用0.45 μm 濾膜抽濾，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，置于10 mL 容量瓶中，乙醇稀釋定容，搖勻，配制成各0、60、120、180、240、300 μg/mL 的混合溶液，按色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)［10］。以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y芹=16248X-50319，r=0.9998;Y槲=160275X-43582，r=0.9996，線性范圍為60～300 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按2.1 項(xiàng)色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果見表1，芹菜素RSD=1.641% (n=6)、槲皮素RSD=1.605%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表1 精密度測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of precision tests

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

制取6 份水煎樣品溶液，按2.3 項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室處理后的濾液按2.1 項(xiàng)色譜條件測(cè)定其峰面積，結(jié)果外敷湯液中芹菜素與槲皮素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.078%、0.106%，RSD 為1.463%、1.378% (n=6)，表明本方法的重現(xiàn)性較好。

2.7 穩(wěn)定性研究

取2.3 項(xiàng)制備的兩種供試溶液，按2.1 項(xiàng)色譜條件，每隔6 h 進(jìn)樣10 μL(3 d 測(cè)7 次)，結(jié)果乙醇外敷液RSD 為2.158%、2.085%(n=7)，而水煎液RSD 為1.836%、1.785%(n=7)，表明兩種外敷液中芹菜素與槲皮素在室溫下3 d 內(nèi)較穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

同批次配制好的藥方材料12 份，各加入0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液5 mL 后按2.3 項(xiàng)的方法制取乙醇與水煎外敷液各6 份并處理外敷液，按2.1 項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果乙醇外敷液中芹菜素與槲皮素平均回收率為100.7% 與99.3%，RSD 為1.538%與1.865%(n=6)，水煎外敷液中芹菜素與槲皮素平均回收率為99.2% 與98.6%，RSD 為2.037%與2.107%(n=6)，因此本法具有較好的回收率。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)、水煎液(B)及乙醇液(C)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard(A)，water-decocted extract(B)and alcohol extract(C)

2.9 樣品測(cè)定

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液與2.3 項(xiàng)的水煎液與乙醇液各10 μL，按2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，其HPLC 檢測(cè)圖譜見圖1，以6 mL/min 與12 min 左右所出峰的峰面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果水煎液中芹菜素與槲皮素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%與0.131%，乙醇液中芹菜素與槲皮素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.316% 與0.268%。

3 討論

由于田老中醫(yī)常年在鄉(xiāng)間用草藥五爪龍等的乙醇液或水煎煮液外敷治療山區(qū)農(nóng)民的瘡毒、痛腫及蛇蟲咬傷，其所用藥料完全一致，只是方中所用溶劑不同，而治療效果差異明顯;HPLC 檢測(cè)的結(jié)果(圖1B、C)也顯示溶劑不同外敷液中藥效成分差異較大，這與治療時(shí)乙醇液比水煎液的治療效果好是一致的，而對(duì)兩外敷液中其它藥效成分還有待進(jìn)一步分析與檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)所用供試液完全按鄉(xiāng)村中醫(yī)提供的藥方和方法制備，并對(duì)外敷液中芹菜素與槲皮素進(jìn)行了初步純化與薄層層析，使其達(dá)到能進(jìn)行HPLC 法檢測(cè)，分離純化后的外敷液在室溫下3 d 內(nèi)較穩(wěn)定，這與民間一副制劑用三天，一天外敷三到五次也是一致的。

本實(shí)驗(yàn)建立的方法具有操作簡(jiǎn)便，能迅速、準(zhǔn)確測(cè)定兩外敷藥液中芹菜素與槲皮素的含量，其精密度、重現(xiàn)性、回收率都較好，此為民間用藥中有效成分的分析與檢測(cè)建立了初步方法。

1 Wang BE(王兵娥)，Huang DH(黃德紅)，Du SQ(杜雙全).Study on the crude drugs feature of Potentilla kleiniana.Chin Pharm J(中國(guó)藥學(xué)雜志)，2005，4:261-264.

2 Yang B(楊濱)，Yue CX(樂(lè)崇熙).Morphological and histological studies on folium and stem of Potentilla.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，1994，25(1):33-36.

3 Dong AW(董愛文).Study on extraction，separation and purification of apigenin from Viola Yedoensis Makino.Hunan Agric Univ(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué))，PhD.2008.

4 Sun B(孫斌)，Qu WJ(瞿偉菁)，Zhang XL(張曉玲).Apigenin pharmacological research.J Chin Med Mater(中藥材)，2004，27:531-534.

5 Zhao WZ(趙維中)，Dei LM(戴俐明)，F(xiàn)ang M(方明)，et al.The studies on pharmacokinetics of quercetin in rabbits.Chin Pharm Bull(中國(guó)藥理學(xué)通報(bào))，1992，8:452-455.

6 Wang YF(王艷芳)，Wang XH(王新華)，Zhu YT(朱宇同).Advancement of researches in quercetin.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，1991，22:182-184.

7 Gao W(高雯)，Shen Y(沈陽(yáng))，Zhang HJ(張紅軍)，et al.The chemical constituents of Potentilla chinensis.Pharm Care Res(藥學(xué)服務(wù)與研究)，2007，7:262-264.

8 Yi RQ(易潤(rùn)青)，Song FY(宋粉云).Determination of saikosaponin a and saikosaponin d in Xiaochaihu granules by capillary electrophoresis.Chin J Pharm(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2012，43:47-50.

9 Ma YD(馬應(yīng)丹)，Chen YJ(陳悅嬌).Determination of quercetin in Ginkgo biloba L.leaves by TLC-UV.J Zhongkai Agrotech Coll(仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào))，2000，13(3):43-45.

10 Zhao YX(趙永昕)，Patigul MHMT(帕提古麗·馬合木提)，Mahbuba ABDRYM(買合布白·阿不都熱依木)，et al.Determination of quercetin in the different part of the Sorbus tianschanica L.by HPLC.Food Sci(食品科學(xué))，2006，27:471-473.