胡松梅，李思長，禹華芳

1湖南婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院，婁底 417000;2湖南九鼎科技有限公司，岳陽 414000

雞足葡萄(Vitis lanceolatifoliosa C.L)為葡萄科葡萄屬多年生木質(zhì)藤本植物［1］，民間常當(dāng)作一種很好的保健品飲用，是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型甜味劑植物，具有較大的開發(fā)利用價(jià)值，其黃酮含量的測定國內(nèi)未見報(bào)道。本文通過分光光度法，對不同產(chǎn)地，不同時(shí)期葉、莖總黃酮含量進(jìn)行測定比較，以期得到含量最高的部位，含量最高的產(chǎn)地，為雞足葡萄將來更好的開發(fā)和利用奠定良好的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)對雞足葡萄的黃酮類成分進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步進(jìn)行其黃酮類化學(xué)成分的分離、鑒定打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料與主要儀器

雞足葡萄采自湖南邵陽和衡山，為春、夏嫩莖葉混合樣。鑒定者為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔣道松教授，憑證樣品保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)。主要儀器為UV-2100雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);LC-20AT 液相色譜儀(日本島津);2537A 短波紫外分析儀(上海分析儀器廠);載玻片;玻板;點(diǎn)樣毛細(xì)管，層析缸，層析用紙。

1.1.2 主要試劑

甲醇(FCP)、鹽酸(AR)、氫氧化鈉(AR)、鎂粉(CP)、鋅粉(CP 無鉛)、硼酸(AR)、薄層層析硅膠G，柱層析聚酰胺(80～100 目)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

取雞足葡萄干粉500 g，75%乙醇浸泡過夜，料液比1∶10，80 ℃溶劑回流兩次，每次4 h，合并，減壓過濾回流提取液得粗提液1、2，將粗提液1 用石油醚萃取數(shù)次直至萃取液石油醚無色為止，除去脂溶色素，將水層揮發(fā)除去殘留石油醚，再用乙酸乙酷等體積萃取數(shù)次，至乙酸乙脂層色淡為止，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回流回收乙酸乙脂，得乙酸乙脂浸膏。

1.2.2 乙酸乙脂浸膏的處理

取部分粗提液的乙酸乙酷浸膏用甲醇溶解后加少許聚酰胺拌樣，揮干溶劑，上聚酰胺柱，用乙醇梯度依次洗脫，洗脫開始后，即按50 mL/份接收洗脫液，同時(shí)用檢測黃酮類物質(zhì)的特征反應(yīng)(HCl-MgCl2)隨時(shí)檢測流出液的情況，至第35 餾份時(shí)開始呈特征反應(yīng)，以上共接受160 瓶洗脫液。

1.2.3 粗提液定性檢驗(yàn)

通過紫外分析儀檢視反應(yīng)、鹽酸-鋅粉反應(yīng)、與金屬離子的絡(luò)合反應(yīng)、四氫硼鈉反應(yīng)、Molish 反應(yīng)等來進(jìn)行黃酮類別的確認(rèn)。

1.2.4 薄層層析鑒別

1.2.4.1 薄層層析鑒別系統(tǒng)的選擇

使用硅膠G 薄層板(點(diǎn)樣量0.5 μL)，經(jīng)過試驗(yàn)，選定3 組展開系統(tǒng)，將粗提液間隔1 cm 多次點(diǎn)樣，待樣點(diǎn)充分干燥后，將硅膠薄層板直立于盛有展開劑的層析缸中，浸沒薄層板下端0.3 cm，上行展開，至展開劑上行至7.5 cm 時(shí)，取出聚酰胺薄層板，用吹風(fēng)機(jī)吹干后于紫外分析儀下檢視。

1.2.4.2 不同產(chǎn)地總黃酮的薄層層析鑒別比較

將粗提液1(湖南衡山)、粗提液2(湖南邵陽)間隔1 cm 多次點(diǎn)樣(點(diǎn)樣量0.5 μL)，待樣點(diǎn)充分干燥后，將硅膠薄層板直立于盛有展開劑的層析缸中，以石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶12∶1 為展開劑展開，浸沒硅膠薄層板下端0.3 cm，上行展開，至展開劑上行至7.5 cm 時(shí)，取出硅膠薄層板，用吹風(fēng)機(jī)吹干后于紫外分析儀下檢視。

1.2.4.3 洗脫液不同餾份的薄層層析鑒別分析

在以上160 餾份中，從第35 份開始，間隔用TLC 方法檢測(吸附劑∶硅膠GF254-CMC-Na，顯色劑:l% AlCl3/EtOH，展開劑見表1)。

表1 各薄層層析方法檢測所用展開劑Table 1 Elution solvents for different TCL methods

1.2.5 紫外光譜掃描

將1 mg 乙酸乙酷浸膏用甲醇(FCP)溶解過濾制得樣品液，又以甲醇(FCP)作參比液，用UV-2100雙光束紫外可見分光光度計(jì)，在波長200～500 nm范圍，對蘆丁、槲皮素、二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.2.6 雞足葡萄總黃酮成份的HPLC 分析

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相:甲醇∶水=60∶40，體積流量:0.09 mL/min，檢測波長:254、290、360 nm。

分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥24 h 的槲皮素、蘆丁、二氫楊梅素對照品，各加甲醇制成200、100、50 μg/mL 的儲(chǔ)備液。以流動(dòng)相為稀釋液配之每1 mL 分別含4 μg 槲皮素、4 μg 蘆丁、1 μg 二氫楊梅素的混合液，作為對照品溶液。

1.2.7 洗脫液不同餾份的HPLC 分析

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相:甲醇∶水=60∶40，流速:0.08 mL/min，檢測波長:254 nm。

在以上160 餾份中，從第35 份開始，間隔取5 mL，轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.145 μm)濾過，取濾液作為供試品溶液。

1.2.8 雞足葡萄的蘆丁含量的測定

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相:甲醇∶水=60∶40，體積流量:1.00 mL/min，檢測波長:257 nm。

1.2.8.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

稱取120 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品14.95 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度。精密吸取上述蘆丁對照品溶液3、6、10、15、20、25 μL(進(jìn)樣量分別為0.897、1.794、2.990、4.485、5.980、7.475 μg)進(jìn)樣檢測，測得峰面積以對照品量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。

1.2.8.2 精密度試驗(yàn)

取濃度為45.07 mg/L 的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5 次，計(jì)算峰值面積，計(jì)算RSD。

1.2.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)在本試驗(yàn)條件下，供試品溶液室溫放置8 h，每隔2 h 進(jìn)料20 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.8.4 回收率試驗(yàn)

精確稱取己知含量的樣品5 份，加入1.5 mg 蘆丁對照品，測定蘆丁的含量，計(jì)算回收率及RSD 值。

1.2.8.5 樣品中蘆丁含量的測定

取產(chǎn)自湖南邵陽的雞足葡萄葉，莖混合干份5份，每份1 g，75%乙醇浸泡過夜，料液比1∶10，80 ℃溶劑回流兩次，每次4 h，合并，減壓過濾回流提取液得粗提液，移入100 mL 的容量瓶中，甲醇定容，得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類化合物定性檢驗(yàn)結(jié)果

粗提液1、2 的定性檢驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2 可以看出，該植物粗提液中含C5-OH 黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、黃酮苷類等，但濃鹽酸反應(yīng)溶液并沒有明顯的粉紅色生成，表明其不含花青素或含量很少。

表2 黃酮類物質(zhì)的定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Qualitative analysis results of flavonoid component

2.2 薄層鑒別

2.2.1 薄層層析鑒別系統(tǒng)的選擇

經(jīng)過初步試驗(yàn)，選定3 組展開系統(tǒng)，分別是石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶12∶1;石油醚∶乙酸乙脂∶甲酸=3∶18∶1;乙酸乙脂∶丙酮∶甲酸∶水=8∶3∶1∶1。3個(gè)系統(tǒng)均有3 個(gè)熒光斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)1 較大，拖尾較嚴(yán)重，可能是多種物質(zhì)混合所致，對3 個(gè)系統(tǒng)的樣品的每個(gè)熒光斑點(diǎn)。展開系統(tǒng)石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=3∶12∶1 的分離度較其它兩個(gè)系統(tǒng)大，分離效果好，且穩(wěn)定，因此更加適合該物種黃酮類物質(zhì)的薄層鑒別分離。

2.2.2 不同產(chǎn)地總黃酮的薄層層析鑒別比較

將粗提液1(湖南衡山)，粗提液2(湖南邵陽)分別在展開系統(tǒng)石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=3∶12∶1中進(jìn)行分離，上行展開，取出硅膠薄層板，用吹風(fēng)機(jī)吹干后于紫外分析儀下檢視，結(jié)果顯示，粗提液2 的斑點(diǎn)數(shù)目比粗提液1 的斑點(diǎn)數(shù)目要高，且分離效果比粗提液1 要好，說明粗提液1 中的黃酮化學(xué)物質(zhì)的種類數(shù)較粗提液2 中豐富，同時(shí)表明采自湖南邵陽的雞足葡萄的黃酮類化學(xué)成分的種類較豐富，有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。

2.2.3 洗脫液不同餾份的薄層層析鑒別分析

在以上160 餾份中，從第35 份開始，間隔用TLC 方法檢測。餾分69、70 最上部的斑點(diǎn)消失，最后根據(jù)各個(gè)餾份的薄層檢測結(jié)果，合并相同餾份，留下濃縮液2、3、4。

2.3 紫外光譜掃描

將乙酸乙脂萃取液用甲醇(FCP)溶解過濾制得樣品液，又以甲醇(FCP)作參比液，用UV-2100 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，在波長200～400 nm 范圍，對蘆丁、槲皮素、二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)液和乙酸乙酯提取液進(jìn)行紫外光譜掃描。見圖1。

圖1 雞足葡萄乙酸乙酯提取液的紫外吸收光譜Fig.1 UV spectrum of ethyl acetate extract of V.lanceolatifoliosa

由圖1 可以看出，雞足葡萄乙酸乙酯提取液在226、290、350 nm 處有特征吸收峰，峰值分別為3.9829、2.5604、1.0994，在350 nm 處的吸收峰較弱，而226 nm 處可能是溶劑所形成的峰，符合雙氫黃酮類的紫外光譜特征，由此推斷該提取液的黃酮類成分的主要物質(zhì)為雙氫黃酮類。

2.4 雞足葡萄總黃酮成分的HPLC 分析

經(jīng)初步分析，將甲醇溶解后的乙酸乙酯萃取液在254 nm 波長下進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2、3。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的HPLC 色譜圖(254 nm)Fig.2 HPLC chromatogram of rutin standard

圖3 乙酸乙酷提取液的HPLC 色譜圖(254 nm)Fig.3 HPLC chromatogram of ethyl acetate extract of V.lanceolatifoliosa

結(jié)合圖2 可以看出，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和乙酸乙酯提取液的出峰時(shí)間一致由此可以推斷該峰為蘆丁，該雞足葡萄中有蘆丁存在，而其它峰的出峰時(shí)間與槲皮素，二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間并不一致，可判定該物種中并不存在上述兩種物質(zhì)。

2.5 洗脫液不同餾份的HPLC 分析

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相:甲醇∶水=60∶40，體積流量:0.09 mL/min，檢測波長:254 nm。濃縮液2、3、4 的HPLC 色譜結(jié)果見圖4。

圖4 濃縮液2(A)、3(B)及4(C)的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of extract 2(A)，3(B)and 4(C)

從上圖可知，蘆丁主要存在于濃縮液3、4 中，在濃縮液3、4 中的主峰之一(出峰時(shí)間5.568 min，5.495 min)的物質(zhì)是該物種黃酮類的主要物質(zhì)，綜合乙酸乙酯萃取液的紫外光譜掃描研究，進(jìn)而確定該物質(zhì)為二氫黃酮類，但該物質(zhì)和其它主峰物質(zhì)的詳細(xì)結(jié)構(gòu)仍然需要通過制備液相色譜、核磁共振等手段進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.6 雞足葡萄的蘆丁含量的測定

2.6.1 蘆丁對照品的全波段掃描

根據(jù)掃描結(jié)果和掃描數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)蘆丁對照品在218、257、358 nm 處有吸收峰，其中257 nm、358 nm處為黃酮類的特征峰，218 nm 處可能是溶劑所形成的峰，且最大吸收峰出現(xiàn)在257 nm 處，故選擇257 nm 做為測定波長。

圖5 蘆丁(0.06 mg/mL)對照品UV 掃描圖Fig.5 UV spectrum of rutin standard(0.06 mg/mL)

2.6.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按前述方法，測定蘆丁的吸收峰面積分別為32.291、50.342、71.991、100.170、127.121、152.512，計(jì)算得到回歸方程，表明蘆丁含量在0.897～7.475 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.6.3 精密度試驗(yàn)

5 次的峰值面積分別為33.717、33.661、33.351、33.153、33.258，計(jì)算RSD=0.73%(n=5)。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在本次試驗(yàn)條件下，測得5 次的供試品溶液的峰面積為33.221、33.214、32.730、32.215、32.126，計(jì)算RSD=1.53%。

2.6.5 回收率試驗(yàn)

回收率結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test result of recovery rate

2.6.6 樣品中蘆丁含量的測定

計(jì)算得該樣品中的蘆丁含量為4.27 mg/g，RSD=l.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

3 討論

黃酮類化合物是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物。如白果雙黃酮和葛根總黃酮等，對心血管疾病有治療作用;木犀草素、輕基芫花素和杜鵑素等能治療氣管炎;竹葉黃酮具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等生物學(xué)功效，在人類的營養(yǎng)、健康和疾病防治上有著廣闊的應(yīng)用前景［2-4］。

雞足葡萄含有的黃酮類化合物是多樣的，并多以苷的形式存在，通過定性檢驗(yàn)、薄層色譜分析、紫外光譜掃描、液相色譜和物理性質(zhì)檢測。結(jié)果證實(shí)，雞足葡萄所含黃酮類化合物的成分主要為黃酮、黃酮醇類(蘆丁)、二氫黃酮類等，而二氫黃酮類的含量較其它成分要高，初步確定黃酮類甜味成分為二氫黃酮類，并測得蘆丁含量為4.27 mg/g。

1 Flora of China Editorial Committee(中國植物志編委會(huì)).Flora of China(中國植物志).Beijing:Science Publishing House，1959.

2 Middleton JR.Biologieal properities of plant flavonoid:a noverview.Int J Phannaeognos，1996，(34):344-348.

3 HAVESTEEN B.Flavonoids，a class of natural produets of high phannaeologieal poteney.Biochemieal Phanneology，1983，32:1141-1148.

4 Zhang Y(張英)，Wu XQ(吳曉琴)，Yu ZY(俞卓裕).Comparison study on total flavonoid content and anti-free redical activity of the leaves of Bamboo，phyllostachys nigra，and Ginkgo bilabo.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2002，27:254-257.