張寬朝，文 漢，胡雅萍，王 雪

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036

黃山貢菊，又稱(chēng)徽菊，是從菊花群體中選育出的優(yōu)良品種，因在古代被作為貢品獻(xiàn)給皇帝，故名“貢菊”［1］。其品質(zhì)優(yōu)良，色、香、味、型集于一體，既有觀賞價(jià)值，又有藥用功能，是安徽黃山市特有的地方名貴中藥材，也是高級(jí)保健飲料佳品，在國(guó)內(nèi)外有很大影響［1-3］。黃山貢菊氣芳香，味甘微苦，具有疏風(fēng)散熱、養(yǎng)肝明目、清涼解毒之功能，可治傷風(fēng)感冒、疔瘡腫毒、血壓偏高及動(dòng)脈硬化等癥，被“中國(guó)藥典”譽(yù)為“菊中之冠”、“民族瑰寶”［2，3］。

黃酮類(lèi)化合物是植物中分布最廣泛的一類(lèi)物質(zhì)，具有多種生理和藥理活性:可以防治心腦血管系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病，具有鎮(zhèn)痛作用、抗凝血作用、利膽及保肝作用、抗氧化作用、抗病毒、抗癌作用等;具有對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)的作用、對(duì)消化系統(tǒng)的作用等［4，5］。已有研究表明，黃山貢菊中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物。因此，對(duì)黃山貢菊中黃酮類(lèi)化合物成分進(jìn)行生物學(xué)活性評(píng)價(jià)等方面的研究具有重要的意義。

實(shí)驗(yàn)采用乙醇回流法從黃山貢菊中提取粗黃酮，以聚酰胺柱層析進(jìn)一步純化，真空冷凍干燥獲得黃酮粉末，對(duì)受試組小鼠灌胃給予不同劑量的貢菊黃酮和聯(lián)苯雙脂，測(cè)定GPT/ALT、GOT/AST、MDA、SOD 值變化，對(duì)比不同劑量貢菊黃酮保肝效果，并對(duì)各組小鼠肝左葉石蠟進(jìn)行切片及HE 染色，觀察其病理學(xué)效應(yīng)，研究貢菊黃酮的保肝作用。

1 材料與方法

1.1 材料

貢菊菊粉由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)處理成粉末狀，120 ℃烘干備用。

四周齡ICR 雄性小鼠(體重20 ±2 g)，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

UV-1600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);HL-2S 恒流泵(上海青浦滬西儀器廠);自動(dòng)部分收集器(上海青浦滬西儀器廠);TH-500A梯度混合器(上海滬西分析儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52(上海亞榮生化儀器廠);722S 型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京德天佑公司);輪轉(zhuǎn)式(SHANDONAS25)切片機(jī);生物顯微鏡(model microscope BM2000)。

1.2.2 試劑

聚酰胺:浙江臺(tái)州市路橋四青生化材料廠，蘆丁:中國(guó)藥品生物制品檢定所，丙二醛(MDA)試劑盒:南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒:南京建成生物工程研究所，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)試劑盒及谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)試劑盒:長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，氯仿、乙醇、HAc、NaOH、二甲苯、蘇木精、石蠟等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取0.10 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL、加30% 乙醇溶液至5 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，震蕩后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L NaOH 溶液2 mL，30%乙醇定容至10 mL，搖勻，以零管為空白，510 nm 測(cè)定吸光度。以蘆丁含量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.001X-0.0017，R2=0.998。

1.3.2 回流法粗提貢菊黃酮

參照文獻(xiàn)方法，有改動(dòng)［6，7］。稱(chēng)取干燥的貢菊粉末，以濾紙包裹，放入250 mL 燒瓶并加入150 mL 70%乙醇，80 ℃水浴回流提取2 h。提取液減壓抽濾，并對(duì)濾液減壓蒸餾至呈無(wú)醇味。濾液于分液漏斗中分別以等體積氯仿、1/2 體積氯仿、1/3 體積氯仿進(jìn)行三次萃取，收集上層水溶液，待聚酰胺層析純化。

1.3.3 貢菊黃酮的聚酰胺層析純化

1.3.3.1 裝柱與預(yù)處理

聚酰胺常規(guī)處置與常規(guī)裝柱。以3～4 倍柱體積的95%乙醇洗脫，至洗脫液透明，再依次用2～2.5 倍體積的5%NaOH 溶液、1 倍體積的蒸餾水、2～2.5 倍體積的10%HAc 溶液洗脫，最后用蒸餾水洗脫至pH 中性備用。

1.3.3.2 加樣、洗脫與收集

常規(guī)加樣。蒸餾水1 mL/min 洗脫至無(wú)色。加入70%乙醇溶劑洗脫，待洗脫下來(lái)的液體帶有醇味時(shí)，隔5 min 用FeCl3溶液檢驗(yàn)，待洗脫液與FeCl3反應(yīng)呈綠色全自動(dòng)部分收集器開(kāi)始收集(1 管/5 min)，待洗脫液與FeCl3反應(yīng)不顯綠色時(shí)停止收集。

1.3.3.3 洗脫曲線的繪制

每隔4 管取1 管，按1.3.1 方法測(cè)吸光度，繪制洗脫曲線。

1.3.4 貢菊黃酮及蘆丁紫外吸收光譜

取貢菊黃酮水溶液及蘆丁溶液，190～600 nm進(jìn)行掃描，以蒸餾水為空白對(duì)照。

1.3.5 貢菊黃酮抗小鼠急性肝損傷作用的研究

1.3.5.1 小鼠急性肝損傷模型的構(gòu)建

將ICR 小鼠分成兩組，10 只小鼠注射0.15 mL的豆油溶液，其它小鼠注射0.15 mL 2%CCl4豆油溶液。禁食12 h 后采血測(cè)所有小鼠(GPT/ALT)含量，取造模成功小鼠。

1.3.5.2 實(shí)驗(yàn)小鼠分組及處理

將造模成功小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、肝損傷模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、黃酮低劑量組、黃酮高劑量組，共計(jì)5 組。按黃酮低劑量組、黃酮高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組分別給予5 mg/mL 低劑量黃酮溶液、15 mg/mL高劑量黃酮溶液、聯(lián)苯雙脂灌胃，空白對(duì)照組、肝損傷模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)8 d，劑量均為每只0.2 mL。第8 d 灌胃給藥1 h 后，空白對(duì)照組腹腔注射0.15 mL 10 mg/mL 豆油溶液，肝損傷模型組、黃酮給藥組、陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射0.15 mL 2% CCl4豆油溶液。禁食12 h 后，黃酮組、陽(yáng)性對(duì)照組分別給予相應(yīng)劑量黃酮液和聯(lián)苯雙脂灌胃，模型組和空白對(duì)照組等量生理鹽水灌胃。30 min 后，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.5.3 小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)活性的測(cè)定

摘除小鼠眼球取血，3000 rpm 離心5 min，得上清即血清。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)活性。

1.3.5.4 小鼠肝組織丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，計(jì)算組織中MDA 含量。

1.3.5.5 小鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定

小鼠頸椎脫臼處死，解剖，肝臟置于冷生理鹽水中，濾紙吸干水分，按1∶9(質(zhì)量體積比)加入生理鹽水，冰浴研磨至漿狀。3000 rpm 離心10 min，上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD 活性。

1.3.5.6 小鼠肝組織的石蠟切片與HE 染色

取1.3.5.2 中處理后小鼠肝臟左葉切一組織塊，立即置于標(biāo)本5 倍總體積的10%中性甲醛中，25 ℃固定48 h，梯度乙醇(30%乙醇-無(wú)水乙醇)脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋切片，HE 染色，光學(xué)樹(shù)脂封片，光鏡下觀察、拍照研究肝臟組織學(xué)病理改變。

1.4 數(shù)據(jù)處理以及分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用EXCEL 2003 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

圖1 聚酰胺層析純化黃酮洗脫曲線Fig.1 The elution curve of flavonoids by column chromatography of polyamide

2.1 聚酰胺層析純化貢菊黃酮

聚酰胺層析純化乙醇回流法從黃山貢菊中提取的粗黃酮，并按1.3.1 檢測(cè)純化過(guò)程，得黃山貢菊黃酮聚酰胺層析純化洗脫曲線如圖1 所示。從圖1 中可以看出，經(jīng)聚酰胺層析后，在1000 mL 洗脫液以內(nèi)時(shí)，貢菊黃酮分布相對(duì)集中，在約150 mL 和300 mL處出現(xiàn)貢菊黃酮洗脫最大值，其后，隨著洗脫的進(jìn)行，貢菊黃酮含量逐漸減少，至1000 mL 以后黃酮含量達(dá)到極低值。

2.2 貢菊黃酮提取液紫外吸收光譜

圖2 貢菊黃酮和蘆丁標(biāo)品紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectrum of flavonoids and rutin standard

大多數(shù)黃酮類(lèi)化合物的紫外光譜中均有兩個(gè)主要的吸收峰組成，分別在240 nm～280 nm 范圍內(nèi)(帶Ⅱ)和300 nm～400 nm 范圍內(nèi)(帶Ⅰ)，但不同類(lèi)型黃酮化合物的帶Ⅰ或帶Ⅱ峰位、峰形和吸收強(qiáng)度存在一定不同。以蘆丁和貢菊黃酮提取液紫外吸收光譜對(duì)比研究，可得圖2。從圖2 可以看出，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在212、261、356 nm 處共有三處吸收峰，而黃山貢菊黃酮分別在204、326 nm 集中出現(xiàn)兩處吸收峰。因此，貢菊黃酮的紫外吸收峰性質(zhì)符合天然黃酮類(lèi)化合物的紫外吸收峰特征。

2.3 貢菊黃酮抗小鼠急性肝損傷的作用

2.3.1 貢菊黃酮對(duì)小鼠血清(GPT/ALT)活性的影響

表1 貢菊黃酮對(duì)小鼠血清(GPT/ALT)活性的影響(n=7，)Table 1 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on GPT/ALT activity(n=7，)

表1 貢菊黃酮對(duì)小鼠血清(GPT/ALT)活性的影響(n=7，)Table 1 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on GPT/ALT activity(n=7，)

注:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，差異顯著，與肝損傷模型組比較。Note:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，compared with liver injury group.

谷丙轉(zhuǎn)氨酶，即GPT/ALT，主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)。作為目前最常用的肝功能指標(biāo)，GPT/ALT 升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致。貢菊黃酮對(duì)小鼠血清(GPT/ALT)活性的影響見(jiàn)表1。從表1 可以看出，肝損傷模型組的小鼠血清(GPT/ALT)酶活高于空白對(duì)照組，達(dá)1%極顯著水平，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)腹腔注射CCl4后，造成小鼠肝細(xì)胞的損傷，引起血清中的(GPT/ALT)含量上升。黃酮低劑量組小鼠血清(GPT/ALT)酶活低于肝損傷模型組，證明貢菊黃酮對(duì)于抗小鼠肝損傷有一定效果，但作用不顯著;黃酮高劑量組小鼠血清的(GPT/ALT)活性明顯低于肝損傷模型組，且作用顯著，達(dá)1%極顯著水平，說(shuō)明貢菊黃酮?jiǎng)┝康脑黾涌梢灾鸩皆鰪?qiáng)抗小鼠肝損傷的效果。

2.3.2 貢菊黃酮對(duì)小鼠血清(GOT/AST)活性的影響

表2 貢菊黃酮對(duì)小鼠血清(GOT/AST)活性的影響(n=6，)Table 2 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on GOT/AST activity(n=6，)

表2 貢菊黃酮對(duì)小鼠血清(GOT/AST)活性的影響(n=6，)Table 2 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on GOT/AST activity(n=6，)

注:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，差異顯著，與肝損傷模型組比較。Note:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，compared with liver injury group.

谷草轉(zhuǎn)氨酶，即GOT/AST，又名天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，主要存在于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)。當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí)，將引起谷草轉(zhuǎn)氨酶在血清中濃度的偏高。貢菊黃酮對(duì)小鼠血清(GOT/AST)活性的影響見(jiàn)表2。從表2 可以看出，肝損傷模型組的小鼠血清(GOT/AST)酶活高于空白對(duì)照組，達(dá)1%極顯著水平，說(shuō)明腹腔注射CCl4造成小鼠肝細(xì)胞的損傷，引起小鼠血清(GOT/AST)含量的上升。同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組和黃酮低劑量組的血清(GOT/AST)活性均高于肝損傷模型組，說(shuō)明聯(lián)苯雙脂和低劑量貢菊黃酮灌胃處理均不能降低血清(GOT/AST)活性，而黃酮高劑量組處理后，(GOT/AST)酶活低于肝損傷模型組，但未達(dá)顯著水平，表明高劑量黃酮能夠一定程度上促進(jìn)肝損傷小鼠(GOT/AST)水平的降低。

2.3.3 貢菊黃酮對(duì)肝組織MDA 含量和SOD 活性的影響

表3 貢菊黃酮對(duì)小鼠肝組織MDA 含量和SOD 活性的影響(n=6，)Table 3 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on the content of MDA and SOD activity(n=6，)

表3 貢菊黃酮對(duì)小鼠肝組織MDA 含量和SOD 活性的影響(n=6，)Table 3 Effect of flavonoids from C.Morifolium cv.Gongju on the content of MDA and SOD activity(n=6，)

注:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，差異顯著，與肝損傷模型組比較。Note:a，P ＜0.05，b，P ＜0.01，compared with liver injury group.

丙二醛(MDA)是機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝過(guò)程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，它可以反映該體系中脂質(zhì)過(guò)氧化自由基的存在及反應(yīng)的程度，是脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞氧化損傷的重要檢測(cè)指標(biāo)。貢菊黃酮對(duì)肝組織MDA 含量的影響見(jiàn)表3。由表3 看出，肝損傷模型組MDA 含量高于空白對(duì)照組，說(shuō)明CCl4豆油溶液引起了小鼠肝臟內(nèi)氧自由基水平的上升，發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。與肝損傷模型組相比，黃酮低劑量組、黃酮高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠肝組織MDA 含量均有下降，表明貢菊黃酮對(duì)降低氧自由基具有一定效果，但黃酮低劑量組作用不顯著，黃酮高劑量組達(dá)5%顯著水平，說(shuō)明高劑量貢菊黃酮可以降低氧自由基水平、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，具有較為明顯的抗肝損傷作用。

SOD 是廣泛存在于需氧生物體內(nèi)的一種金屬酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，是體內(nèi)脂質(zhì)氧化的敏感指標(biāo)，能催化超氧陰離子自由基產(chǎn)生歧化反應(yīng)，可抑制黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，減少體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，減輕肝細(xì)胞損傷程度［8-10］。由表3 可以看出，肝損傷模型組SOD 活力水平明顯低于空白對(duì)照組，說(shuō)明CCl4損傷小鼠肝細(xì)胞，造成SOD 活性的降低。貢菊黃酮低劑量組和高劑量組肝組織SOD 活性均高于肝損傷模型組，表明貢菊黃酮具有提高小鼠肝組織SOD 活性，清除超氧陰離子自由基的能力，但未達(dá)顯著水平。同時(shí)，由表3 可以發(fā)現(xiàn)，聯(lián)苯雙脂對(duì)于提高肝臟細(xì)胞SOD 活力沒(méi)有效果。

2.3.4 貢菊黃酮對(duì)急性化學(xué)性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響

貢菊黃酮對(duì)急性化學(xué)性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。從中可以看出，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠肝組織的結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，且基本無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);急性肝損傷模型組小鼠的肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜破裂，結(jié)構(gòu)不完整，胞漿呈疏松化，核深染，可見(jiàn)明顯的點(diǎn)狀和灶狀壞死。與肝損傷模型組相比，貢菊黃酮低、高劑量組和聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組肝臟組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，基本正常，損傷明顯減少，壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。

圖3 化學(xué)性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)切片F(xiàn)ig.3 Histopathology of biopsies of mice with chemical liver injury

3 討論與結(jié)論

四氯化碳慢性肝損傷模型是研究抗肝炎藥物保肝作用的一個(gè)常用的動(dòng)物模型，其主要是CCl4進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450 代謝為三氯甲基自由基攻擊肝臟生物大分子，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，引起肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血清中ALT、AST 釋出升高［9，10］。

本研究采用乙醇回流法從黃山貢菊中提取粗黃酮，聚酰胺柱層析純化，真空冷凍干燥獲得黃酮粉末，對(duì)以四氯化碳造模的急性肝損傷小鼠分別給予聯(lián)苯雙酯及不同劑量的貢菊黃酮灌胃，測(cè)定了血清中GPT/ALT、GOT/AST 活性，測(cè)定了肝組織中SOD活性和丙二醛含量，HE 染色觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)的改變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃山貢菊黃酮可以降低急性肝損傷小鼠血清中GPT/ALT、GOT/AST 活性，提高肝組織SOD 活性，降低丙二醛含量，可不同程度地改善肝臟病理組織損傷。

聯(lián)苯雙酯是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷引起轉(zhuǎn)氨酶升高的常用藥物，可減輕因四氯化碳所致的肝臟損害和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)升高，對(duì)四氯化碳所致的肝臟微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化、四氯化碳代謝轉(zhuǎn)化為一氧化碳有抑制作用，并降低四氯化碳代謝過(guò)程中還原型輔酶Ⅱ及氧的消耗，從而保護(hù)肝細(xì)胞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。比較貢菊黃酮和聯(lián)苯雙脂的用藥效果可以發(fā)現(xiàn)，聯(lián)苯雙脂對(duì)(GPT/ALT)和MDA作用明顯，而貢菊黃酮不僅能降低血清(GPT/ALT)和(GOT/AST)活性，減少肝組織MDA 含量，還能提高肝組織SOD 活性。

因此，貢菊黃酮對(duì)抗小鼠急性肝損傷作用有明顯藥理學(xué)效果，具有良好的保肝作用，其作用機(jī)理可能與提高清除自由基酶的活性、增強(qiáng)機(jī)體清除自由基能力、減少自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、保護(hù)肝細(xì)胞、維持肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性等有關(guān)。貢菊黃酮的研究對(duì)保肝藥物的研發(fā)具有重要意義。

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