俞 和，王香粉，紀(jì)彥南，徐 燕，田沙沙，朱華結(jié)

河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 071000

木霉(Trichoderma)是一類普遍存在的真菌，常見于土壤中，是土壤微生物的重要群落，從植物根圍、葉圍、種子及球莖表面，植物殘體及腐朽木材上都可以分離到。某些木霉具有活性很強(qiáng)的纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等水解酶類，可用于生產(chǎn)纖維素酶和微生物源的糖蛋白以及用于植病生防［1］。綠色木霉、里氏木霉和哈茨木霉由于能夠產(chǎn)生多種酶系，對其研究也比較深入［2-5］。木霉中次級代謝產(chǎn)物也比較豐富，劉淑瑩等在哈次木霉中分離得到了一系列的蒽醌類化合物［6］，杜林等從海洋木霉中分離得到11個sorbicillinoid 類化合物［7］。為進(jìn)一步研究木霉菌的次級代謝產(chǎn)物，我們對木霉Trichoderma sp.KK19L1 的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。

1 儀器與材料

德國BrukerAvance Ⅲ600 MHZ 核磁共振儀(TMS 為內(nèi)標(biāo)，δ 為ppm，J 為Hz);高分辨傅里葉變換離子回旋質(zhì)譜儀(德國Bruker);循環(huán)半制備色譜儀(日本島津公司);Polarimeter Type AA-55 型數(shù)字式旋光儀。

Sephadex LH-20(Pharmacia 公司產(chǎn)品);C18 反相填料(北京慧得易科技有限責(zé)任公司分裝);薄層色譜和正向柱色譜硅膠(青島海洋化工);薄層硅膠GF254(煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所);石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等有機(jī)溶劑均為工業(yè)純經(jīng)重蒸后使用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的分離、篩選

從河北省保定市河北大學(xué)的校園內(nèi)采集一份土樣，在無菌條件下將土樣溶于200 mL 無菌水中，震蕩使之溶解充分，取上清液進(jìn)行梯度稀釋，濃度依次為原液的10-1～10-9倍。取各個梯度稀釋液0.2 mL涂布在PDA 培養(yǎng)基的平板中，待生長出菌落時挑出，在新的平板中培養(yǎng)純化，最終得到并鑒定為木霉菌(Trichoderma sp.KK19L1)菌株。

2.2 提取與分離純化

對木霉菌(Trichoderma sp.KK19L1)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，共發(fā)酵120 L。過濾、濃縮后得到水相10 L，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，減壓濃縮后得到乙酸乙酯層浸膏20 g，經(jīng)硅膠(200～300 目)柱層析，二氯甲烷-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脫，合并相同組分，各組分再經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，Sephadex LH-20 和RP-18 反相柱色譜分離純化以及C18高效液相制備得:化合物1(17.5 mg)、化合物2(10 mg)、化合物3(7 mg)(圖1)。

圖1 化合物1～3 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of 1-3

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 淡黃色粉末，溶于二氯甲烷，分子式為C13H14O3;mp.60 °C;UV(CH2Cl2)λmax347 nm;IR(VCD)νmax1756，1667，1607，1590，1248 cm–1;HR-ESI-MS(positive):m/z ［M+Na］+=241.08336(calcd.for:241.08352)。計算得到不飽和度為7。從13C NMR 和DEPT 譜可以判斷化合物有2個甲基，一個連氧的亞甲基，2 個雙鍵上的次甲基，一個2 取代的苯環(huán)，2 個羰基，其中一個為酯羰基(172.3 ppm，單位下同)。通過COSY 相關(guān)，確定H-3(6.34)、H-4(7.24)、H-5(6.52)、H-6(7.06)依次相連接且為苯環(huán)上的氫，由此可斷定苯環(huán)上為鄰位取代。H-2'(6.32)、H-3'(7.08)、H-4'(1.94)依次連接，同時H-3'(7.08)和H-4'(1.94)為雙鍵上的氫。通過HMBC 譜，發(fā)現(xiàn)羰基(C-8，197.6)連接C-2(125.0)。同時C-9(27.8)與羰基(C-8，197.6)相連。H-7(4.94)與C-1(125.0)、C-5(128.6)、C-6(147.8)有強(qiáng)相關(guān)，且C-6 為季碳，所以確定C-7 與C-6 相連接。C-7 為連氧的亞甲基且H-7(4.94)與C-1'(172.3)有強(qiáng)相關(guān)，可確定C-7 與C-1'中間連氧，為酯基結(jié)構(gòu)。其核磁數(shù)據(jù)及二維相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。通過2D NMR(HMQC、HMBC、COSY)數(shù)據(jù)確定其平面結(jié)構(gòu)為1。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，該化合物為一新化合物。命名為(E)-3-acetylbenzyl but-2-enoate。其主要二維相關(guān)如圖2。

圖2 化合物1 的主要HMBC 和COSY 相關(guān)Fig.2 Key HMBC and COSY correlations of compound 1

表1 化合物1 的核磁數(shù)據(jù)Table 1 1H NMR，13C NMR and COSY data of compound 1

化合物2 黃色粉末，溶于二氯甲烷，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:7.27(1H，m，H-2)，7.62(1H，m，H-3)，7.79(1H，m，H-4)，8.27(2H，m，H-5，H-8)，7.09(1H，d，J=7.56 Hz，H-7)，12.54(1H，s，OH);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:162.8(C-1)，124.2(C-2)，134.4(C-3)，120.0(C-4)，127.3(C-5)，148.6(C-6)，134.1(C-7)，126.8(C-8)，188.0(C-9)，182.6(C-10)，133.6(C-11)，133.1(C-12)，116.1(C-13)，133.3(C-14)，22.2(CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報道一致，因此鑒定為1-hydroxy-6-Methyl-9，10-anthraquinone。

化合物3 白色針晶，溶于二氯甲烷，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:12.54(1H，s，OH)，6.36(2H，m，H-6，H-8)，4.62(2H，d，J=6.6 Hz，CH2OH)，3.88(3H，s，OCH3)，3.04(1H，t，J=6.6 Hz，OH)，4.48(3H，s，CH3);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:164.6(C-2)，118.3(C-3)，182.3(C-4)，104.9(C-4a)，162.1(C-5)，98.1(C-6)，165.6(C-7)，92.3(C-8)，157.7(C-8a)，17.9(CH3)，56.7(CH2OH)，55.8(OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報道一致，因此鑒定為5-羥基-3-羥甲基-2-甲基-7-甲氧基色原酮(5-hydroxy-3-hydroxymethyl-2-methyl-7-methoxychromone)，在該木霉菌中首次發(fā)現(xiàn)。

1 Zhang CL(章初龍)，Xu T(徐同).Classification research of Trichoderma sp.J Yunnan Agric Univ(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報)，2000，15(3):269-274.

2 HvanJP，MohulatsiM.Biodegration of waste paper by celluase from Trichodermaviride.Bioresource Technology，1996，86:21-23.

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6 Liu SY(劉淑瑩).Study on the anthraquinones separated from the cultivation of Trichoderma harzianum strain Th-R16 and their biological activity.J Agric Food Chem，2009，57:7288-7292.

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8 Liu T(劉濤)，Li ZL(李占林)，Wang Y(王宇)，et al.The secondary metabolites research of marine fungus Hypocreavirens.J Shenyang Pharm Univ(沈陽藥科大學(xué)學(xué)報)，2012，29(2):93-97.