韓寒冰，王明陽，馬 超，李海航

1廣東石油化工學院化學與生命科學學院;2 茂名出入境檢驗檢疫局，茂名 525000;3華南師范大學生命科學學院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣州 510631

蔓花生(Arachis duranensis)為蝶形花科蔓花生屬多年生宿根草本植物，原產于亞洲熱帶及南美洲。由于其生長快、再生能力強、根系發(fā)達、抗逆性強、四季常青、花色鮮艷和觀賞性強，在南方各省作為地面覆蓋物或園藝觀賞被廣泛種植［1］。蔓花生的莖葉營養(yǎng)豐富，口感好，易消化，是動物的良好牧草［2］。栽培種花生為異源四倍體，是由二倍體野生型花生雜交、加倍形成。蔓花生作為花生二倍體野生型的種質資源，具有較強的抗病、抗蟲和抗干旱能力，在花生基因改良中的作用越來越受到人們的重視［3，4］。

白藜蘆醇(3，4'，5-三羥基二苯乙烯)、白藜蘆醇苷(白藜蘆醇的葡萄糖苷)和二苯乙烯苷(2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-O-β-D-葡萄糖苷)為常見的二苯乙烯類天然活性物質。白藜蘆醇和白藜蘆醇苷是植物體內抵抗病原菌侵染的一類重要的植物抗毒素，并有顯著的抗癌抑癌、心血管保護、抗氧化和清除自由基等藥理作用［5，6］。白藜蘆醇及其苷主要存在于虎杖、葡萄和花生等植物中，以虎杖中的含量最高。二苯乙烯苷具有抗衰老、降血脂、保肝護肝、促智、抗腫瘤等作用，是何首烏的主要藥效成分［7］。人們通常用乙醇溶液提取法提取，并用HPLC 法測定其含量，本實驗除了利用乙醇溶液輔助超聲提取法外，還使用了柱層析提取法。目前，對蔓花生中二苯乙烯類化合物的研究尚未見報道，因此，本實驗對蔓花生中的二苯乙烯類化合物進行了含量測定，為綜合利用蔓花生，探索二苯乙烯類化合物的資源開發(fā)，改良花生種質資源，提高花生的食用和保健價值提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

植物材料采集于廣州石牌華南師范大學校園內，經華南師范大學生命科學學院王英強教授鑒定為蔓花生(Arachis duranensis)，整株或根莖葉分別置50 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后過40 目篩，備用。

白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和二苯乙烯苷對照品購于成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%。甲醇和乙腈等色譜純溶劑為美國Burdick ＆ Jackson Inc.(Muskegon，MI，USA)產品，其它試劑均為分析純。

Agilent 1200 高效液相色譜儀(VWD 檢測器)，美國安捷倫公司;QUATTRO Premier XE 型三重四級桿串聯質譜儀，美國WATERS 公司;DL-6000 低速冷凍大容量離心機，上海安亭科學儀器廠;KQ5200B 超聲波清洗器，江蘇省昆侖山市超聲儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱，上海滬粵明科學儀器有限公司。

1.2 樣品的制備

1.2.1 HPLC-DAD 定性分析樣品

稱取整株、根、莖或葉粉末各1 g，分別置于10 mL 提取管中，加入6 mL 60%乙醇溶液，密封，超聲提取30 min，離心，上清液過0.22 μm 濾膜，濾液供HPLC-DAD 檢測。

1.2.2 UPLC-MS/MS 定性分析樣品

用柱層析提取法提?。?］。取10 g 蔓花生莖粉末，用60% 的乙醇溶液濕樣上柱，浸泡2.0 h，以60%乙醇溶液為洗脫溶劑，洗脫液流速40 mL/h，收集洗脫液40 mL 濃縮后，經大孔樹脂D101 純化，用0.22 μm 濾膜過濾，濾液供UPLC-MS/MS 定性分析。

1.2.3 HPLC 定量分析樣品

用柱層析提取法［8］提取。分別稱取蔓花生根、莖、葉或整株粉末5 g，采用直徑為1.25 cm 的玻璃層析柱，以60%乙醇溶液為提取溶劑，浸泡2.0 h，收集洗脫液體積除葉以4.5 mL/g 為一個收集單位(即一份)外，其余均以4.0 mL/g 為一份，共提取四份。洗脫液用0.22 μm 濾膜過濾，HPLC 法分別測定各提取液中二苯乙烯類化合物的含量。

1.3 對照品溶液的制備

1.3.1 HPLC-DAD 定性分析對照品混合液

按白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和二苯乙烯苷分配為50、150 和350 μg/mL 配制而成。

1.3.2 HPLC 定量分析對照品混合液

分別以2.5、5、7.5、10、12.5 μg/mL 的白藜蘆醇標準溶液，5、10、15、20、25 μg/mL 的白藜蘆醇苷標準溶液和25、50、75、100、125 μg/mL 的二苯乙烯苷標準溶液制作三種化合物的濃度與峰面積關系的標準曲線。根據樣品中各化合物的峰面積計算樣品中各化合物的含量。

穩(wěn)定性：取同一批稻谷，在 0h、2h、4h、6h、8h 各測定一次，計算出葉黃素提取量的RSD為1.22%，表明樣品溶液在8h內基本穩(wěn)定。

1.4 HPLC-DAD 分析條件

色譜條件:色譜柱為依利特ODS1 柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm，大連依利特公司)，柱溫40 ℃;流動相:甲醇(A)-1%乙酸水溶液(B);梯度洗脫程序:0～14 min，25%～28%A;14～30 min，28%～30%A;流速1.0 mL/min;檢測波長為303 nm;進樣量10 μL，樣品與對照品疊加試驗的進樣量為20 μL，HPLC-DAD 的掃描波長為190～400 nm。

1.5 UPLC-MS/MS 分析條件

UPLC-MS/MS 分析儀器為QUATTRO Premier XE 型三重四級桿串聯質譜儀(美國WATERS 公司);色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm);流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫程序:0～1 min，20% A;1～1.5 min，20%～50%A;1.5～2.5 min，50% A;2.5～3.0 min，20%A;流速:0.25 mL/min，柱溫:40 ℃，進樣量10 μL。質譜條件:電噴霧離子源(ESI)，負離子檢測，離子噴霧電壓(IS)為3.5 kV，離子源溫度(TEM)為110℃，氣簾氣(CUR)為47 L/Hr，霧化氣(GAS1)為700 L/Hr，采集方式為多反應監(jiān)測(MRM)模式，離子選擇以靈敏度高和穩(wěn)定性好為前提條件。

2 結果與分析

2.1 HPLC-DAD 的定性分析

用HPLC 分別測定了根、莖、葉和整株提取液，結果見圖1。與對照品混合液比較，除葉提取液在二苯乙烯苷相應的位置沒有明顯出峰之外(圖1D)，其余的在白藜蘆醇苷、二苯乙烯苷和白藜蘆醇相應的保留時間均有峰出現，用等量的對照品混合溶液與莖提取液混合做疊加實驗(圖1C)，結果保留時間與原來的保持一致，峰面積也與各自峰面積總和相等。因此，可以初步判斷蔓花生中存在被鑒定的三種二苯乙烯類化合物，根莖中二苯乙烯苷含量高，葉中檢測不到，白藜蘆醇含量相對較低。分別對對照品、樣品和疊加實驗的對應峰進行紫外吸收光譜掃描(DAD)，發(fā)現有一致的紫外吸收峰，白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的兩個最大吸收峰波長分別為303 nm 和320 nm，二苯乙烯苷的最大吸收峰的波長為320 nm。因此，可以進一步確定樣品中含有三種二苯乙烯類化合物。

圖1 蔓花生提取液中白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和二苯乙烯苷的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of resveratrol，polydatin and stilbene glucoside in the extracts of A.duranensis

2.2 UPLC-MS/MS 定性分析

對純化的樣品提取液進行一級質譜全掃描，發(fā)現準離子的分子量分別為227.0、388.9、404.9 的三種化合物(圖2)。與對照品白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和二苯乙烯苷的負離子的相對分子量227.2、389.0和404.8 相吻合。分別對疑似白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和二苯乙烯苷三種化合物離子峰進行二級掃描，得到二級質譜圖(圖3)，其碎片離子及離子強度均與對照品二級質譜圖顯示的結果一致。圖3A 中的碎片子離子m/z 185.1、159.1、143.1 等與文獻［9］分析白藜蘆醇的裂解規(guī)律和MS2一致，可以確定m/z為227.0 是白藜蘆醇。圖3B 中得到的三個接近m/z 為227.0 的碎片，與白黎蘆醇苷母離子裂解丟失一個取代葡萄糖基(-C6H10O5)生成的苷元，白黎蘆醇負離子的m/z 為227.0 相符，并與文獻［10］對白藜蘆醇苷(虎杖苷)的分析結果一致，因此，確定m/z為388.9 的化合物為白黎蘆醇苷。圖3C 中主要碎片子離子m/z 242.9、243.3，與m/z 為404.9 的母離子裂解丟失一個取代葡萄糖基團(-C6H10O5)后m/z 為242.9 相符，其二級質譜圖與文獻［7］的分析結果相同，因而，確定m/z 404.9 為二苯乙烯苷。

圖2 莖樣品中白藜蘆醇(m/z=227.0)、白藜蘆醇苷(m/z=388.9)和二苯乙烯苷(m/z=404.9)質譜圖Fig.2 MS spectrum showing resveratrol (m/z=227.0)，polydatin (m/z=388.9)and stilbene glucoside(m/z=404.9)in stem extracts

圖3 蔓花生樣品中白藜蘆醇(A)、白藜蘆醇苷(B)和二苯乙烯苷(C)的二級質譜圖Fig.3 MS2 spectra of resveratrol (A)，polydatin (B)and stilbene glucoside (C)in stem extracts

2.3 不同器官中二苯乙烯類化合物的含量

2.3.1 標準曲線與線性范圍

分別以三種對照品的濃度為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線，得到白藜蘆醇的回歸方程為A=50724x+1542.2，R2=0.9998，線性范圍為2.5～12.5 μg/mL，白藜蘆醇苷的回歸方程為A=27947x-2889.5，R2=0.9992，線性范圍為5～25 μg/mL，二苯乙烯苷的回歸方程為A=33810x-1614.8，R2=0.9999，線性范圍為25～125 μg/mL。

2.3.2 精密度試驗

將對照品混合溶液重復進樣5 次，根據峰面積分別計算出三種成分的含量和RSD 值，三種對照品的RSD 值均小于1%，表明檢測方法的精密度良好。

2.3.3 重復性試驗

取莖提取液樣品5 份，分別用HPLC 檢測，根據峰面積計算三種成分的RSD 值，白藜蘆醇苷為1.18%，二苯乙烯苷為0.97%，白藜蘆醇為1.22%，表明檢測方法的重復性良好。

2.3.4 溶液穩(wěn)定性試驗

取莖提取液于室溫下分別放置0、2、4、6、8 h后，HPLC 檢測。根據三種化合物的峰面積計算檢測的RSD 值，白藜蘆醇苷為2.05%，二苯乙烯苷為3.24%，白藜蘆醇為1.41%，說明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定。

2.3.5 加標回收率試驗

精密吸取莖提取液2.0 mL，各平行三份，分別加入對照品混合液(白藜蘆醇15 μg/mL，白藜蘆醇苷30 μg/mL，二苯乙烯苷150 μg/mL)1 mL、1.5 mL、2.0 mL，定容到10 mL，HPLC 測定各樣品的加樣回收率，結果見表2。白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和二苯乙烯苷的平均回收率分別為99.78%、98.76%和98.93%。

2.3.6 定量限和檢測限

取蔓花生莖提取液，逐漸稀釋，進樣10 μL，記錄色譜圖，按10 倍信噪比計算，測得提取液的定量限為69.22 ng/mL，按3 倍信噪比計算，測得提取液檢測限為24.81 ng/mL。

表1 加樣回收率試驗結果(n=3，)Table 1 Results of recovery rates of the 3 investigated compounds (n=3，)

表1 加樣回收率試驗結果(n=3，)Table 1 Results of recovery rates of the 3 investigated compounds (n=3，)

2.3.7 二苯乙烯類化合物提取次數的考察

圖4 柱層析法提取蔓花生中二苯乙烯類化合物Fig.4 Extraction rates of stilbene compounds from A.duranensis by the column chromatographic extraction method

用柱層析提取法提取，收集4 份提取液，HPLC檢測含量，以4 份提取液中含量的總和作為目標成分的總含量。每份提取液中白藜蘆醇苷、二苯乙烯苷和白藜蘆醇的提取率見圖4。第1 份的提取率均達到90%以上，第2 份為5%～10%之間，第3 份1%～2%，第4 份均檢測不到三種成分。因此，只需測定三份提取液中目標成分的含量就可準確得出材料中各成分的含量。

2.3.8 蔓花生中二苯乙烯類化合物的含量

用柱層析提取法提取各樣品，收集三份洗脫液，合并后，用HPLC 測定提取液中目標成分的含量。分別測定了蔓花生葉、莖、根及整體植株中三種二苯乙烯類化合物的含量，結果見表2。根、莖和葉中的白藜蘆醇含量較接近，均不及白藜蘆醇苷的一半，根莖中二苯乙烯苷含量較高，是白藜蘆醇的8～10 倍，但葉中檢測不到二苯乙烯苷，莖中三種二苯乙烯類化合物的總量最高。

表2 蔓花生不同器官中二苯乙烯類化合物的含量(μg/g)Table 2 Contents of stilbene compounds in different organs of A.duranensis (μg/g)

3 討論

采用HPLC-DAD 和UPLC -MS/MS 法首次從蔓花生中鑒定了白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和二苯乙烯苷。通過柱層析提取法和HPLC 檢測，準確測定了根莖葉和整體植株中三種二苯乙烯類化合物的含量，結果表明，除葉中檢測不到二苯乙烯苷外，三種器官中都檢測到二苯乙烯類化合物，其中莖中三種化合物的含量均最高。三種化合物中，白藜蘆醇在各器官中的含量最低、二苯乙烯苷的含量最高。莖、根和葉中三種二苯乙烯類化合物的總含量分別為1158.25、863.66 和318.09 μg/g。目前，同時研究白黎蘆醇和白藜蘆醇苷的材料主要有中藥虎杖、桑椹和葡萄，其中虎杖中的含量最高，達到2%～3%［5］。桑椹中白藜蘆醇含量為8～21.9 μg/g，白藜蘆醇苷含量為16.8～133.8 μg/g［11］。研究發(fā)現白藜蘆醇普遍存在于豆科、葡萄科、百合科、蓼科等植物中，但含量都普遍很低，花生中根莖葉的白藜蘆醇含量普遍在100 μg/g 左右［12］，葡萄皮中白黎蘆醇的含量為50～100 μg/g，葡萄酒中白黎蘆醇的含量為1.5～3 mg/L［13］。由于含量低，要從中提取分離活性成分比較困難。蔓花生中二苯乙烯類化合物的含量比花生、葡萄和桑椹等植物均高得多，加之它的資源豐富，成本低，可作為二苯乙烯類化合物原料。蔓花生作為畜牧業(yè)飼料的原料，由于含有較高的二苯乙烯類化合物，對提高動物的抵抗力，減少疾病的發(fā)生有一定的作用。

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