王麗波 于澤源 徐雅琴 郝永峰 肖振平 張曉松

南瓜籽中一種抗真菌蛋白的提取及抗菌活性研究

王麗波 于澤源 徐雅琴 郝永峰 肖振平 張曉松

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030）

裸仁南瓜籽經(jīng)破碎，磷酸緩沖液4℃浸提，硫酸銨沉淀，上清液透析，SP-Sepharose FF陽離子交換層析，Sephadex G-75凝膠層析柱，凍干等步驟純化得到一種新的抗真菌蛋白，命名為Pw-1，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行初步鑒定。SDS-PAGE分析顯示Pw-1蛋白的分子質(zhì)量約為14.8 ku?？咕钚澡b定表明，該蛋白對(duì)黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和鏈格孢霉菌3株真菌具有顯著的生長抑制活性，并呈現(xiàn)出劑量依賴的特征，IC50值分別為16.64、20.91和21.22μmol／L。加入胰蛋白酶后Pw-1蛋白的抗菌活性消失，表現(xiàn)出蛋白類物質(zhì)所具有的對(duì)于蛋白酶的敏感性。

南瓜籽 抗真菌蛋白 純化

南瓜籽又名南瓜仁，白瓜籽，金瓜籽，為葫蘆科植物南瓜的成熟種子。南瓜籽中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、植物甾醇以及各種礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分［1-3］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為南瓜籽味甘性溫，歸脾胃大腸經(jīng)，有驅(qū)蟲、下乳、健脾利水之功效，是一味藥食兩用的中藥［4］。

現(xiàn)代研究表明南瓜籽中含有多種具有離體抑制真菌生長增殖能力的活性蛋白，如Xia等［5］從南瓜籽中提取出分子質(zhì)量約為29 ku的活性蛋白，具有N-糖苷酶活性，并對(duì)人類黑色素瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。Ng等［6］從南瓜籽中提取出2種分子質(zhì)量均為12 ku的小分子蛋白，都有抑制蛋白質(zhì)合成的活性。Wang等［7］從黑南瓜籽中提取到富含精氨酸、谷氨酸和甘氨酸的分子質(zhì)量為8 ku的抗真菌蛋白。這些活性蛋白未來可作為天然防腐劑用于食品保鮮和保藏，以及用于抗農(nóng)作物病蟲害和醫(yī)藥的研究和應(yīng)用等，具有廣泛的研究意義。

本研究以裸仁南瓜籽為材料提取其總蛋白，通過兩步層析分離，純化得到一種抗真菌蛋白，并對(duì)該蛋白的分子質(zhì)量和抗菌活性進(jìn)行研究，為深入開展制備植物種子來源的抗真菌蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與儀器

寶庫1號(hào)裸仁南瓜籽：訥河市寶庫良種繁育研究所；SP交聯(lián)瓊脂糖凝膠、G-75葡聚糖凝膠：浙江爭(zhēng)光實(shí)業(yè)股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白（14.4～116 ku）：加拿大Pharmacia公司；黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、大豆灰斑病菌（Cercospora sojina Hara）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院。所用試劑均為分析純。

Z36型高速冷凍離心機(jī)：德國Hermle公司；Fdu-1100冷凍干燥機(jī)：日本Eyela公司；FW80型高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；lhs-25sc恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 南瓜籽抗真菌蛋白的純化

500 g南瓜籽經(jīng)過低溫干燥后粉碎，過0.2 mm孔徑篩網(wǎng)，加入2 L磷酸鹽緩沖液（10 mmol／L，pH 7.0，含0.15 mol NaCl）、4℃勻漿，浸提6 h（同一樣品反復(fù)浸提3次），離心（4℃，12 000 r／min，15 min），上清液加入硫酸銨至30%飽和度，置于4℃ 10 h，12 000 r／min冷凍離心，收集上清液。加入硫酸銨至80%飽和度，12 000 r／min離心，沉沉淀用少量浸提緩沖液溶解后透析（MW 3.5 ku），12 000 r／min離心 10 min，收集上清液，冷凍干燥，所得蛋白為南瓜籽粗蛋白。

將上述粗蛋白0.5 mL（30 mg／mL）用平衡緩沖液充分透析平衡后，上樣于SP-Sepharose FF陽離子交換柱上（1.0 cm×30 cm），在10 mmol／L醋酸（pH 4.5）緩沖體系中，用0～1 mol／L NaCl梯度洗脫，流速為1.0 mL／min，280 nm檢測(cè)。將各收集管組分透析冷凍干燥，以黃瓜枯萎病菌作為指示菌檢測(cè)抗菌活性。

將有活性的洗脫組分充分透析，冷凍干燥后0.5 mL（30 mg／mL）進(jìn)一步用 Sephadex G-75凝膠層析柱（1.5 cm×20 cm）分離，pH 6.5，5 mmol／L的 PB緩沖液洗脫，控制流速為0.5 mL／min。收集洗脫峰，以黃瓜枯萎病菌作為指示菌測(cè)定各洗脫組分的抗真菌活性。

1.2.2 SDS-PAGE測(cè)定分子質(zhì)量

SDS-PAGE參考 Laemmli等［8］方法，用 Tris-HCl緩沖液，分離膠濃度15%，濃縮膠濃度5%，含0.1%SDS，恒壓200 V，電泳3 h。電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.3 真菌生長抑制活性測(cè)定

采用牛津杯法［9］測(cè)定各層析收集組分的真菌生長抑制活性。受檢真菌為黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和鏈格孢菌。將供試菌株點(diǎn)植于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）平板中心，于28℃培養(yǎng)至菌落直徑達(dá)到1～2 cm，在距離菌落邊緣1 cm處放置滅菌的牛津杯，各取100μL樣品組（含目的蛋白）和對(duì)照組（0.02 mol／L、pH 6.6 PBs緩沖液 100μL），用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后加入牛津杯內(nèi)，4℃預(yù)擴(kuò)散24 h，28℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察有無抗菌作用。

1.2.4 抑真菌半抑制濃度（IC50）的測(cè)定

參照Liu等［10］方法，將抗真菌蛋白混入約45℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體，每份總體積為15 mL，濃度分別為 0、5、10、20μmol／L。迅速混勻后分別倒入平皿（9 cm）待冷卻后接入少量等量菌體，放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌體生長5 d后，測(cè)量加入空白對(duì)照的菌圈直徑（D c）和加入樣品的菌圈直徑（D n）。抑制率I＝（D c-D n）／D c，根據(jù)抑制率和樣品濃度繪制曲線，可求得半抑制濃度IC50，本試驗(yàn)檢測(cè)了抗真菌蛋白對(duì)黃瓜枯萎菌、大豆灰斑菌、鏈格孢菌3種菌的半抑制濃度，每個(gè)濃度平行3次，測(cè)量時(shí)取其菌圈的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用quantity one軟件定量分析了SDS-PAGE圖譜。

2 結(jié)果和分析

2.1 南瓜籽抗菌蛋白的分離純化

南瓜籽粗蛋白經(jīng)SP-Sepharose陽離子交換柱分離，得到 A、B、C、D、E、F共 6個(gè)蛋白洗脫峰（圖1），用黃瓜枯萎病菌為指示菌，用平板擴(kuò)散法測(cè)定各峰抗菌活性，結(jié)果顯示C和E峰具有抗真菌活性。且E峰活性較高，所以選擇E峰進(jìn)一步純化。

將E峰組分上樣于Sephadex G-75凝膠層析柱進(jìn)一步分離，得到兩個(gè)洗脫峰分別稱為I、II（圖2），抗菌活性檢測(cè)結(jié)果表明，峰I具有較高的抗真菌活性，峰II沒有抗菌活性。

經(jīng)磷酸緩沖液浸提，硫酸銨鹽析，透析和冷凍干燥，從500 g南瓜籽中提取到1.9 g粗蛋白，E峰組分經(jīng)透析凍干后總質(zhì)量為70.4 mg，I峰洗脫液透析凍干后得到21.7 mg的終蛋白。

圖1 南瓜籽抗真菌蛋白的SP-Sepharose FF陽離子交換層析

圖2 陽離子交換層析活性洗脫峰E的Sephadex G-75凝膠排阻層析

2.2 抗真菌蛋白分子質(zhì)量測(cè)定

SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，所提取的南瓜籽粗蛋白（泳道B）組分較多，經(jīng)過兩步層析之后，I峰蛋白（泳道A）呈單一條帶，說明其已達(dá)到電泳純。具有抗真菌活性的I峰蛋白命名為Pw-1。

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率Rf為橫坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lg Mr為縱坐標(biāo)（x），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y＝-1.112 7x+2.017 9，R2＝0.990 6，根據(jù)Pw-1蛋白的相對(duì)遷移率0.818，得出其分子質(zhì)量為14.8 ku。

圖3 南瓜籽抗真菌蛋白Pw-1的SDS-PAGE分析

2.3 真菌生長抑制活性檢測(cè)

Pw-1蛋白抗菌效果如圖4所示，其對(duì)黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和鏈格孢霉菌均有抑制作用（圖4a、b、c）。由表1的抑菌圈的直徑大小可以說明，Pw-1蛋白對(duì)黃瓜枯萎病菌和大豆灰斑病菌的效果更顯著一些，隨著抗真菌蛋白濃度增加抗菌活性更高，呈現(xiàn)清晰的劑量依賴效應(yīng)。而在相同條件下，對(duì)照組菌絲擴(kuò)散沒有受到影響，菌落邊緣呈現(xiàn)規(guī)則的圓形。并且由圖4d可知，加入胰蛋白酶后抗菌活性消失，Pw-1蛋白表現(xiàn)出蛋白類物質(zhì)所具有的對(duì)于蛋白酶的敏感性。

圖4 Pw-1蛋白的抗真菌效果

表1 Pw-1蛋白對(duì)3種菌的抗菌作用對(duì)比

2.4 半抑制濃度

不同濃度的Pw-1蛋白對(duì)三種菌的抑制效果如圖5，根據(jù)抑制率（y）和濃度（x）做曲線，分別求得黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌、鏈格孢菌的IC50回歸方程。分別為 y＝0.028 1x+0.034 7（R2＝0.991 8）、y＝0.023 4x+0.019（R2＝0.989 5）、y＝0.023 7x+0.012 1（R2＝0.992 5）。根據(jù)各自的回歸曲線測(cè)得Pw-1蛋白對(duì)黃瓜枯萎病菌的 IC50值為16.64 μmol／L，對(duì)大豆灰斑病菌的 IC50值為 20.91μmol／L，對(duì)鏈格孢菌的IC50值為21.22μmol／L。

圖5 Pw-1蛋白對(duì)3種菌的IC50

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從裸仁南瓜籽中提取出了一種抗真菌蛋白Pw-1，通過 SDS-PAGE分析，分子質(zhì)量為14.8 ku，不同于已報(bào)道的分子質(zhì)量分別為8、12 ku的南瓜籽抗真菌蛋白，是一種新的抗真菌蛋白。Pw-1蛋白對(duì)3株常見的農(nóng)業(yè)致病真菌黃瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌和鏈格孢霉菌有顯著的生長抑制作用，當(dāng)?shù)鞍兹芤簼舛葹?0μg／L時(shí)，抗菌圈直徑分別為9.4、8.3和8.0 mm，IC50值分別為 16.64、20.91和 21.22 μmol／L。這些數(shù)據(jù)將為進(jìn)一步研究Pw-1蛋白的氨基酸序列、其他生物活性以及抗菌機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and Characterization of a Novel Antifungal Protein from Pumpkin Seeds

Wang Libo Yu Zeyuan Xu Yaqin Hao Yongfeng Xiao Zhenping Zhang Xiaosong
（College of Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

A novel antifungal protein is measured to be isolated from pumpkin seeds and designated Pw-1.The purification procedure consists of extraction with phosphoric acid buffer at 4℃，ammonium sulfate precipitation，dialysis，SP-Sepharose FF column，Sephadex G-75 column，freeze drying and other processes.Partial characterization and antifungal activity are assayed in the paper.The molecular mass of the purified Pw-1 was determined as 14.8 ku by SDS-PAGE.The protein exhibited antifungal activity to the Fusarium oxysporum，Cercospora sojina Hara，and Alternaria alternata in a dose-dependent with IC50values of 16.64，20.91，and 21.22μmol／L respectively.The antifungal activity of Pw-1 protein disappeared after trypsin addition，showing the protease sensitivity of protein.

pumpkin seeds，antifungal protein，purification

Q516

A

1003-0174（2014）03-0063-04

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究（12531052），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)青年啟動(dòng)基金（2011QN208）

2013-04-24

王麗波，女，1979年出生，講師，天然產(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用

于澤源，男，1961年出生，教授，園藝作物的采后加工和處理