徐定華，唐雯熙，張曉蓉*，李 杰，劉繼旋

1吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首 416000

青蒿酸是黃花蒿(Artemisia annuaL.)植物中倍半萜類成分之一［1-4］，化學(xué)構(gòu)象適宜，具有重要的藥用和開發(fā)價(jià)值，我國資源豐富。研究表明青蒿酸具有較好的抗腫瘤活性，對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人白血細(xì)胞K562、白血病P388 等多種癌細(xì)胞具有殺傷作用［5，6］。還可減少C/EBPδ mRNA 的水平，抑制hAMSCs 的生脂分化［7］。青蒿酸為青蒿素生物合成重要前體，有望低成本體外轉(zhuǎn)化為青蒿素，近年來青蒿酸制備技術(shù)也隨之發(fā)展，已有多種青蒿酸分離純化工藝報(bào)道，如采用反相高效液相色譜法分離青蒿酸［8］，產(chǎn)物純度大于96%;采用皂化-硅膠柱層析法從青蒿酸提取母液制備青蒿酸［9］，純度達(dá)95%。也有報(bào)道通過單流程工藝制備較高純度青蒿酸［10］。國外有報(bào)道通過酵母轉(zhuǎn)基因技術(shù)生物合成青蒿酸。雖然已有多種青蒿酸制備工藝報(bào)道，目前青蒿酸尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，一些關(guān)鍵技術(shù)還有待解決;有關(guān)青蒿酸生物穩(wěn)定性未見相關(guān)報(bào)道。青蒿酸分子含有一個(gè)羧基，4，5-位以及11-位碳雙鍵易斷裂，通過紫外光斷裂11-位雙鍵，插入一個(gè)甲基和2 個(gè)氫，生成二氫青蒿酸，青蒿酸在光氧化條件下氧化其4，5-位雙鍵，生成烯丙過氧氫，提供氯化氫條件，甲酯化生成青蒿酸甲酯，分子中雙鍵使青蒿酸具有一定不穩(wěn)定性［11-13］?；谇噍锼嶂匾拈_發(fā)應(yīng)用價(jià)值，本文探究了溶劑法、吸附分離法制備青蒿酸，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了表征，分析了青蒿酸的生物穩(wěn)定性，以期為青蒿酸的工業(yè)開發(fā)與利用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黃花蒿(Artemisia annuaL.)為野外采集，由吉首大學(xué)陳功錫教授鑒定。青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC ＞99%，批號(hào)120628，四川省維克奇生物科技有限公司)。

島津高壓液相色譜儀(LC-10AT，天津島津液壓有限公司)，干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，申光熔點(diǎn)儀(WRR，上海精科)，紫外分光光度計(jì)(天津島津液壓有限公司)，紫外燈(253.7 nm，30 W)，高分辨質(zhì)譜儀(MAT95XP，美國Thermo Finnigan 公司)，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，甲醇(HPLC，上海國藥)，乙腈(HPLC，上海國藥)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青蒿酸制備工藝

將1000 g 黃花蒿植物于60 ℃干燥至恒重，粉碎，過40 目篩，甲醇浸提24 h/次，3 次，植物∶甲醇=1∶10、1∶10、1∶5(g/mL)。合并濾液，濃縮，浸膏乙醚溶解，并加入堿液24 h 反應(yīng)后，收集堿液層，濃HCl 調(diào)pH=1，24 h 反應(yīng)，再加入乙醚，萃取，收集乙醚，濃縮，浸膏硅膠柱層析分離，收集青蒿酸流份，濃縮，乙酸乙酯溶解浸膏，-20 ℃結(jié)晶，收集青蒿酸結(jié)晶，真空干燥，備用。

1.2.2 青蒿酸表征

1.2.2.1 青蒿酸溶液配制

精確稱量青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品及青蒿酸樣品各10 mg，色譜甲醇溶解，容量瓶定量至10 mL，母液濃度為1 mg/mL，備用。實(shí)驗(yàn)用青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液及青蒿酸樣品溶液均采用色譜甲醇稀釋。

1.2.2.1 熔點(diǎn)測(cè)定

取5 mg 青蒿酸晶體于50 ℃干燥至恒重，研磨，于熔點(diǎn)儀中測(cè)定其熔點(diǎn)，重復(fù)3 次。

1.2.2.2 UV-vis 表征

青蒿酸甲醇溶液于比色皿掃描分析，波長范圍200～450 nm 掃描，以甲醇為空白對(duì)照，測(cè)定青蒿酸最大吸收峰。

1.2.2.3 TLC 分析

展層劑:石油醚-乙酸乙酯-丙酮(80∶19∶1，v/v/v);顯色劑:香草醛-無水乙醇-濃硫酸(0.5 g∶9 mL∶1 mL);顯色溫度:100～110 ℃;顯色時(shí)間:5～10 min。

1.2.2.4 HPLC 檢測(cè)

精密吸取青蒿酸樣品溶液10 μL，注入液相色譜儀，紫外檢測(cè)器測(cè)定峰面積。色譜柱條件:wondas II C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(7∶3，v/v);流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃，紫外檢測(cè)波長為203 nm。

青蒿酸濃度計(jì)算公式如下:

1.2.2.5 質(zhì)譜分析

青蒿酸溶解于乙醚溶液用于質(zhì)譜檢測(cè)分析。質(zhì)譜檢測(cè)條件為毛細(xì)管溫度180 ℃，噴霧電壓5 kV，離子透鏡補(bǔ)償電壓15 V，碰撞能量20%～42%，殼氣為氮?dú)猓?xì)管電壓38 V，注射泵流速3 μL/min。

1.2.3 生物穩(wěn)定性檢測(cè)

光照條件:取三組供試青蒿酸樣品溶液，第一組采用自然光照室溫保存，第二組用錫箔紙包裹避光室溫保存。第三組供試樣品溶液分別以每孔300 μL 加入96 孔板，室溫紫外燈下照射，光照距離20 cm，取樣待檢。

溫度條件:取三組供試青蒿酸樣品溶液，第一組4 ℃條件下避光保存，第二組室溫條件下避光保存，第三組60 ℃條件下避光保存，取樣待檢。

保存時(shí)間:供試青蒿酸溶液，室溫避光保存。植物樣品為野外采集，自然陰干，室溫避光貯藏，植物青蒿酸含量檢測(cè)采用甲醇室溫提取，1年保存時(shí)間。

HPLC 法檢測(cè)生物活性，青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液濃度均為0.08 mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿酸制備工藝

黃花蒿青蒿酸制備工藝流程如圖1 所示。制備工藝設(shè)計(jì)了有機(jī)溶劑提取、反萃取-萃取粗分離、吸附柱分離及結(jié)晶、真空干燥等4 個(gè)操作單元制備。青蒿酸分子中含有一個(gè)羧基，屬于極性分子，制備工藝選用極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑甲醇提取。青蒿酸呈弱酸性，為弱電解質(zhì)，工藝采用5% NaOH 皂化及濃HCl 還原，利用反萃取及乙醚萃取粗分離。通過硅膠柱吸附分離法以及石油醚結(jié)晶精制，得到青蒿酸產(chǎn)品。通過該工藝產(chǎn)物得到青蒿酸結(jié)晶350 mg，制備工藝的產(chǎn)率為61.7%，青蒿酸制備工藝物料平衡及產(chǎn)品收率總結(jié)于表1。

圖1 青蒿酸制備工藝流程圖Fig.1 Preparation process of artemisinic acid

表1 青蒿酸制備工藝物料平衡及產(chǎn)品收率Table 1 Material balance and product yield of artemisinic acid by preparation process

2.2 青蒿酸表征

采用HPLC 法對(duì)產(chǎn)物青蒿酸進(jìn)行了純度檢測(cè)，對(duì)青蒿酸晶體進(jìn)行了UV-vis、熔點(diǎn)、TLC、質(zhì)譜表征，結(jié)果如圖2 所示。產(chǎn)物青蒿酸純度為96% (圖2 A)。青蒿酸晶體透明，小立方形(圖2B 插圖所示)。青蒿酸晶體甲醇溶解后，紫外檢測(cè)表明最大吸收峰為220 nm;青蒿酸結(jié)晶熔點(diǎn)為130(132 ℃;TLC 檢測(cè)表明青蒿酸的Rf值為0.42(圖2 C 箭頭所示);質(zhì)譜檢測(cè)其質(zhì)子峰為［M］+234(圖2 D)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［1］。

圖2 青蒿酸表征Fig.2 Characterization of artemisinic acid

2.3 青蒿酸生物穩(wěn)定性分析

2.3.1 溫度穩(wěn)定性分析

青蒿酸具有適宜化學(xué)構(gòu)象，不僅可生物轉(zhuǎn)化為青蒿素，且具有重要的藥用用途，保持其生物穩(wěn)定性是其開發(fā)利用的前體。因此，探究了4 ℃、室溫、60℃等溫度條件下青蒿酸生物穩(wěn)定性。采用TLC 法、HPLC 法對(duì)3 種溫度條件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 的青蒿酸含量動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了定性定量分析。TLC 分析結(jié)果顯示，4 ℃、室溫、60 ℃條件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 后青蒿酸斑點(diǎn)清晰可見，Rf值均為0.46(圖略)。進(jìn)一步采用HPLC 法對(duì)不同溫度條件下保存的青蒿酸含量進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果如圖3 A、B、C 所示。由檢測(cè)結(jié)果可知，4 ℃、室溫、60 ℃條件下保存0、12 h、2、5、15、30 d 青蒿酸HPLC 檢測(cè)保留時(shí)間均為12.6 ± 0.2 min。根據(jù)公式計(jì)算可知，3 種條件下青蒿酸濃度基本保持不變，分別為0.08、0.08 ±0.01 mg/mL 以及0.075 ±0.05 mg/mL，可見青蒿酸在4～60 ℃溫度條件下具有較好的生物穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度保存條件青蒿酸含量HPLC 分析Fig.3 Content analysis of artemisinic acid preserved under different temperatures by HPLC

2.3.2 光穩(wěn)定性分析

以避光條件為對(duì)照，研究了青蒿酸對(duì)紫外光及自然光的生物穩(wěn)定性。TLC 分析結(jié)果顯示，自然光照條件保存0、12 h、2、5、15、30 d 青蒿酸斑點(diǎn)仍清晰可見，與避光保存青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)顯示一致。將青蒿酸進(jìn)行紫外光照0、2、4、6、8、10、12 h，TLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)青蒿酸斑點(diǎn)隨著紫外照射時(shí)間延長，斑點(diǎn)逐漸變小，顏色變淡，6 h 后青蒿酸斑點(diǎn)完全消失(圖略)。進(jìn)一步對(duì)自然光及紫外光處理的青蒿酸含量進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 A 檢測(cè)結(jié)果可見，自然光照條件下青蒿酸吸收峰與避光保存標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰一致，含量穩(wěn)定，檢測(cè)濃度保持在0.07～0.08 mg/mL。紫外光照處理后(圖4 B)，青蒿酸含量隨著紫外光照時(shí)間延長逐漸降低，紫外光照2 h 后青蒿酸濃度降為0.04 mg/mL，4 h 后降為0.02 mg/mL，紫外光照8 h 后青蒿酸幾乎完全被光解。以上結(jié)果表明，自然光照條件下青蒿酸具有較好的穩(wěn)定穩(wěn)定性，青蒿酸對(duì)紫外光非常敏感。

圖4 不同光照保存條件青蒿酸含量HPLC 分析Fig.4 Content analysis of artemisinic acid preserved under different lights by HPLC

2.3.3 青蒿酸保存時(shí)間分析

室溫避光貯藏條件下，對(duì)體外及植物體內(nèi)保存的青蒿酸生物穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。HPLC 檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示。由圖5A 檢測(cè)結(jié)果顯示，在體外保存1年后，青蒿酸吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰一致，含量穩(wěn)定，濃度保持在0.07～0.08 mg/mL。由圖5B 檢測(cè)結(jié)果可知，植物體在自然條件下保存1年后，青蒿酸含量基本穩(wěn)定，濃度約為1.5%～1.6%，生物穩(wěn)定性良好。以上結(jié)果表明，植物體內(nèi)外保存一年時(shí)間青蒿酸生物活性穩(wěn)定良好。

圖5 植物體內(nèi)外保存青蒿酸含量HPLC 分析Fig.5 Content analysis of artemisinic acid preserved in and out of plant by HPLC

3 討論

青蒿酸具有重要的開發(fā)利用價(jià)值。本文探究了青蒿酸制備工藝，通過該工藝可高效制備青蒿酸產(chǎn)品，純度達(dá)96%。產(chǎn)物青蒿酸紫外最大吸收峰為220 nm，熔點(diǎn)為130～132 ℃，質(zhì)譜［M］+234。生物穩(wěn)定性分析表明，4～60 ℃以及自然光照條件下，保存30 d 青蒿酸生物穩(wěn)定性的保持良好，含量保持0.08 mg/mL 不變。但紫外光對(duì)青蒿酸具有極強(qiáng)的破壞作用，紫外照射6 h 后青蒿酸基本檢測(cè)不出，有報(bào)道青蒿酸在紫外條件下，4，5-位以及11-位碳雙鍵斷裂發(fā)生氧化反應(yīng)［8］，該結(jié)果與文獻(xiàn)相符。室溫條件下，青蒿酸在植物體內(nèi)外保存1年含量基本穩(wěn)定，生物穩(wěn)定性好。青蒿酸良好的生物穩(wěn)定性為其開發(fā)利用提供了廣闊前景。

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