田永奇，甘建紅，吳文惠*

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306

海綿出現(xiàn)于寒武紀(jì)，是最原始、最簡(jiǎn)單的多細(xì)胞動(dòng)物，分布極為豐富，自赤道到兩極不同深度的海域都有海綿的存在。已知的海綿有1 萬余種，其顏色、形狀千姿百態(tài)，大小、質(zhì)量相差非常大(直徑1～15 m)。為了抵御外族的侵襲和惡劣的海洋環(huán)境，海綿群體在上億年的積累中產(chǎn)生了很多化學(xué)防御物質(zhì)。而這些化學(xué)防御物質(zhì)由于具有新穎的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的生物活性，如今已經(jīng)成為科學(xué)家研究的熱點(diǎn)［1-2］。

軟海綿屬尋常海綿綱(Demospongiae)，軟海綿目(Halichondrida)，軟海綿科(Halichondridae)，在亞熱帶地區(qū)的海綿中較為常見。Halichondria屬軟海綿多與其共生體如細(xì)菌等生活在一起，通過過濾海水?dāng)z入大量微生物有機(jī)體，產(chǎn)生各種各樣的特異性代謝產(chǎn)物，如大環(huán)內(nèi)酯、萜類、鞘類脂糖苷、甾醇、生物堿、內(nèi)酰胺等。其中很多化合物都具有新穎的結(jié)構(gòu)和顯著的抗菌、抗腫瘤等生物活性［3］。1986年Hirata and Uemura［4］等從Halichondria okadai中分離得到Halichondrin B，以其為先導(dǎo)化合物研制而成的藥物Eribulin 作為治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的新型藥物，已經(jīng)于2010年9月15 日在美國(guó)上市。1996年，Kuramoto［5］等從Halichondria.okadai 中分離到halichlorine，該化合物能夠抑制血管黏附分子VCAM-1的誘導(dǎo)表達(dá)。具有該作用的化合物對(duì)于動(dòng)脈硬化、冠心病、非心血管感染性疾病等有治療作用。1997年Kobayashi［6］等從日本沖繩島軟海綿Halichondriasp.中發(fā)現(xiàn)化合物halishigamides A～D 其對(duì)鼠淋巴瘤L1210 細(xì)胞和人表皮樣瘤KB 細(xì)胞均有細(xì)胞毒作用。Chill［7］等從Halichondriasp.中分得1 個(gè)新的結(jié)構(gòu)新穎的四環(huán)雙哌啶halichondramine，但未報(bào)到其生物活性。2007年張紅軍［8］等從Halichondria rugosa中分離得到一個(gè)酯甾醇化合物，具有有較強(qiáng)的體外抗HIV-1 蛋白酶和抗HIV-1 整合酶活性。2012年，Naonobu Tanaka［9］等從Halichondriasp.分離出2個(gè)結(jié)構(gòu)非常新穎的倍半萜二聚體，它們對(duì)KB 腫瘤細(xì)胞株均具有中等的細(xì)胞毒性。

我國(guó)南海海綿資源極為豐富，為了尋找結(jié)構(gòu)新穎且有藥用活性的先導(dǎo)化合物，我們對(duì)2009年3月采集于海南西沙群島的Halichondriasp.進(jìn)行了化學(xué)成分研究。從二氯甲烷與甲醇(1∶1)提取物中分離得到了了7 個(gè)結(jié)構(gòu)很新穎的化合物，經(jīng)現(xiàn)代波譜技術(shù)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)照，確定其結(jié)構(gòu)分別為:4α-Isocyanogorgon-11-Ene(1)，Homoverrucosanol (2)，neoverru--cosanol(2)，5α，6α-Epoxy-(22E)-ergosta-8，14，22-triene-3β，7α-diol (3)，5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol (4)，(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6α，9α-tetrol(6)，3β，5α，9α，14β-tetrahydroxy-(22E)-ergosta-7，22-dien-6-one(7)(結(jié)構(gòu)見圖1).對(duì)首次從該屬中分離得到的化合物進(jìn)行了體外活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)化合物1與化合物3 對(duì)HeLa 顯示出較弱的細(xì)胞毒性，其IC50值分別為33.7 μM 和43.8 μM。本文主要報(bào)道以上7 個(gè)化合物的分離純化以及結(jié)構(gòu)鑒定工作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料

TLC:高效薄層層析板(HPTLC)為德國(guó)Merck公司產(chǎn)品和煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司產(chǎn)品。顯色劑:10%硫酸香蘭素溶液。EYELAN-1000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。HPLC:Waters 1525/2996，2998 HPLC;Agilent 1200;YMC-Pack(C8250 × 10 mm)。溶劑系統(tǒng)(石油醚:乙酸乙酯)，(石油醚:丙酮)，(正己烷:異丙醇)，(二氯甲烷:甲醇)等。常用有機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)的分析純。

軟海綿Halichondriasp.于2009年3月采集于海南西沙永興島，樣品由中科院海洋研究所李錦和教授鑒定，現(xiàn)保存于第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院海洋藥物實(shí)驗(yàn)室，編號(hào)為SHT。

圖1 化合物1～7 的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of compounds 1-7

1.2 提取與分離

將浸泡于95%乙醇溶液中的海綿樣品(濕重3 kg)取出，剪碎，放入3 L 的玻璃瓶中，加入甲醇和二氯甲烷各1000 mL 超聲提取7 次。將原95%乙醇浸泡液與超聲提取液合并旋蒸至無醇味。用乙酸乙酯提取出有機(jī)相。分別用正己烷，二氯甲烷，正丁醇萃取。得到正己烷層75.3 g，二氯甲烷層18 g，正丁醇層50 g。二氯甲烷層首先用凝膠柱(甲醇與二氯甲烷各500 mL)洗脫，分為D1～D3，D2(10 g)用反向硅膠柱梯度洗脫以甲醇(M)∶水(W)(3∶7，2∶3，1∶1，3∶2，7∶3，4∶1，9∶1)為流動(dòng)相。得到14 個(gè)餾分(D2A～D2N).D2I 經(jīng)硅膠柱分離，后采用高效液相色譜(YMC-Pack C8250 × 10 mm，2 mL/min)制備。以M∶W(3:1)為流動(dòng)相得到化合物1(2.6 mg)。D2L 經(jīng)硅膠柱分離以石油醚(P):乙酸乙酯(E)(20∶1，10∶1，5∶1，1∶1)乙酸乙酯為流動(dòng)相，分離得到(D2L1～D2L8).D2L1 經(jīng)硅膠柱洗脫(P∶E=30∶1)得到化合物2(221.3 mg)，化合物3(11.2 mg)。D2M 經(jīng)硅膠柱洗脫(P∶E=20∶1，10∶1，5∶1，1∶1)，得到化合物4(10 mg)，化合物5(112.3 mg)，化合物6(6.3 mg)，化合物7(16 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色油狀物，ESI-MSm/z:263［M］+。分子式為C16H25NO2。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:4.10(1H，d，J=6 Hz，H-11)，3.97(1H，d，J=6 Hz，H-11)，2.24(1H，m，H-3)，1.87(1H，ddd，J=13.2，11.4，4.8 Hz，H-6)，1.73(1H，m，H-7)，1.67(1H，m，H-2)，1.60(1H，m，H-8)，1.53(1H，m，H-1)，1.47(1H，d，J=13.2 Hz，H-5)，1.47(1H，m，H-9)，1.45(1H，m，H-3)，1.42(1H，m，H-8)，1.26(3H，s，H3-14)，1.24(3H，s，H3-13)，1.15(1H，m，H-7)，1.06(1H，m，H-1)，1.00(1H，m，H-9)，0.98(3H，s，H3-15).13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:158.8(C-16)，79.2(C-12)，68.2(C -11)，62.0(C-4)，59.7(C-5)，43.9(C-9)，40.8(C-1)，40.4(C-6)，39.9(C-3)，34.1(C-10)，26.5(C-7)，23.6(C-13)，20.9(C-4)，20.5(C-2)，19.3(C-15)，18.6(C-14)。其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1 為4α-Isocyanogorgon-11-Ene。

化合物2 白色固體，ESI-MSm/z:290 ［M］+。分子式為C20H34O。1H NMR(600Hz，CDCl3)δ:5.29(1H，d，J=5 Hz，H-2)，3.60(1H，ddt，J=2，3，11 Hz，H-5)，2.54(1H，ddd，J=2，11，13 Hz，H-4)，2.20(1H，dd，J=5，12 Hz，H-1)，2.05(1H，m，H-15)，2.03(1H，m，H-4)，1.89(1H，ddd，J=2，3，13 Hz，H-6)，1.76(3H，s，H3-18)，1.71(1H，ddt，J=3，7，11 Hz，H-13)，1.60(1H，m，H-12)，1.54(1H，dt，J=4，14 Hz，H-8)，1.47(1H，dd，J=11，13 Hz，H-6)，1.40(1H，m，H-9)，1.38(1H，m，H-12)，1.37(1H，m，H-11)，1.32(1H，dt，J=3，14 Hz，H-9)，1.23(1H，dt，J=3，14 Hz，H-8)，1.16(1H，t，J=11，H-14)，1.03(1H，q，J=11 Hz H-11)，0.86(3H，d，J=7 Hz，H3-17)，0.86(3H，s，H3-19)，0.83(3H，d，J=7 Hz，H-16)，0.78 (3H，s，H3-20)。13C NMR (150 MHz，CDCl3)δ:131.7(C-2)，131.3(C-3)，65.6(C-5)，58.9(C-6)，47.8(C-14)，46.8(C-13)，43.8(C-1)，42.6(C-4)，42.6(C-10)，39(C-8)，38.8(C-11)，38(C-7)，35.1(C-9)，28.0(C-15)，25.8(C-18)，22.9(C-17)，21.4(C-12)，20.0(C-19)，18.1(C-20)，14.9(C-16)。其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物2 為homoverrucosanol。

化合物3 白色固體，ESI-MSm/z:290［M］+分子式為C20H34O。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:4.03(1H，dd，J=7，11 Hz，H-5)，2.15(1H，m，H-15)，1.90(1H，m，H-13)，1.69(1H，dd，J=7，13 Hz，H-6)，1.60(1H，m，H-12)，1.42(1H，m，H-9)，1.40(1H，m，H-12)，1.37(1H，m，H-11)，1.35(1H，m，H-9)，1.29(1H，dt，J=4，13 Hz，H-8)，1.19(1H，s，H-18)，1.16(1H，t，J=12 Hz，H-14)，1.10(1H，ddd，J=2，4，13 Hz，H-8)，1.05(1H，m，H-11)，1.02(1H，dd，J=4，12 Hz，H-1)，0.91(1H，d，J=7 Hz，H-17)，0.85(1H，ddd，J=4，5，8 Hz，H-2)，0.83(1H，s，H-19)，0.82(1H，d，J=7 Hz，H-16)，0.74((1H，s，H-20)，0.68(1H，dd，J=11，13 Hz，H-6)，0.56(1H，dd，J=5，8 Hz，H-3)，0.28(1H，t，J=5 Hz，H-3)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:71.2(C-5)，47.6(C-1)，47.2(C-6)，46.9(C-14)，45.2(C-13)，44(C-10)，39.2(C-11)，37.1(C-7)，35.3(C-8)，34.6(C-9)，28.7(C-15)，25.8(C-18)，25.6(C-2)，22.7(C-17)，22.0(C-4)，21.6(C-12)，19.6(C-3)，18.6(C-20)，17.2(C-19)，14.9(C-16)。其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3 為neoverrucosanol。

化合物4 無色針晶，ESI-MSm/z:426 ［M］+。分子式C28H42O3。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:6.5(1H，dd，J=1.8，3.3 Hz，H-15)，5.33(1H，dd，J=7.3，15.4 Hz，H-23)，5.28(1H，dd，J=8.1，15.4 Hz，H-22)，4.34(1H，dd，J=2.6，11.2 Hz，H-7)，3.02(1H，d，J=2.6 Hz，H-6)，3.82(1H，m，H-3)，2.45(1H，ddd，J=3.3，7.3，16.9 Hz，H-16)，2.18(1H，dd，J=11.4，16.9 Hz，H-16)，2.31(1H，m，H-20)，1.87(1H，dd，J=11.4，12.8 Hz，H-4)，1.63(1H，m，H-17)，1.13(3H，d，J=6.6 Hz，H3-21)，1.00(3H，d，J=6.6 Hz，H3-28)，0.92(3H，d，J=7.0 Hz，H3-27)，0.91(3H，d，J=7.0 Hz，H3-26)，0.84(3H，s，H3-18)，0.83(3H，s，H3-19)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:146.9(C-14)，139.1(C-9)，136.0 (C-22)，132.5 (C-23)，123.9 (C-15)，123.0(C-8)，68.3(C-3)，67.7(C-7)，65.2(C-5)，62.5(C-6)，56.6(C-17)，45.6(C-13)，43.3(C-24)，39.5(C-4)，39.3(C-20)，38.9(C-10)，37.6(C-16)，35.7(C-12)，33.4(C-25)，31.3(C-1)，30.8(C-2)，23.5(C-11)，23.1(C-19)，21.3(C-21)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，18(C-28)，15.6(C-18).其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物4 為5α，6α-Epoxy-(22E)-ergosta -8，14，22-triene-3β，7α-diol。

化合物5 無色針晶，ESI-MSm/z:428［M］+分子式C28H44O3。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:6.49(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，6.23(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，5.20(1H，dd，J=7.6，15.2 Hz，H-23)，5.12(1H，dd，J=7.6，15.2 Hz，H-22)，3.94(1H，m，H-3)，2.08～1.49(20H，m)，1.06(3H，s，H-19)，0.97(3H，d，J=6.4 Hz，H-21)，0.89(3H，d，J=5.2 Hz，H-28)，0.86(3H，s，H-18)，0.83(3H，d，J=4.8 Hz，H-26)，0.82(3H，d，J=4.8 Hz，H-27)。13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:135.5(C-6)，135.2(C-22)，132.4(C-23)，130.8(C-7)，82.1(C-5)，79.4(C-8)，66.5(C-3)，56.3(C-17)，51.7(C-14)，51.2(C-9)，44.6(C-13)，42.8(C-24)，39.7(C-20)，39.4(C-12)，37.0(C-4)，37.0(C-10)，34.6(C-1)，33.1(C-25)，30.2(C-2)，28.6(C-16)，23.4(C-11)，20.9(C-21)，20.6(C-15)，19.6(C-27)，19.1(C-26)，18.2(C-19)，17.6(C-28)，12.9(C-18)。其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13，14］報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物5 為5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol。

化合物6 無定型粉末，ESI-MSm/z:446［M］+。分子式C28H46O4。1H NMR(600 Hz，CDCl3)δ:5.22(1H，dd，J=7.7，15.4 Hz，H-23)，5.17(1H，dd，J=7.7，15.4 Hz，H-22)，5.06(1H，dd，J=1.8，1.8 Hz，H-7)，4.03(1H，m，H-3)，3.96(1H，brs，H-6)，2.25(1H，ddd，J=4.0，13.6，13.6 Hz，H-1)，1.95(1H，d，J=12.1 Hz，H-2)，2.48(1H，m，H-14)，2.02(1H，m，H-20)，1.05(3H，s，H3-19)，1.02(1H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.92(3H，d，J=7.0 Hz，H3-28)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H3-27)，0.82(3H，d，J=7.0 Hz，H3-26)，0.58(3H，s，H3-18)。13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:142.6(C-8)，135.4(C-22)，132.7(C-23)，120.3(C-7)，77.1(C-5)，74.5(C-9)，70.3(C-6)，67.3(C-3)，55.8(C-17)，50.5(C-14)，43.8(C-13)，42.8(C-24)，41.0(C-10)，40.4(C-20)，40.2(C-4)，35.1(C-12)，33.1(C-25)，30.3(C-2)，28.1(C-16)，28.0(C-11)，26.5(C-1)，22.8(C-15)，21.1(C-21)，20.3(C-19)，20.0(C-27)，19.6(C-26)，17.6(C-28)，11.7(C-18)。其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物6 為(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6α，9α-tetrol(6)。

化合物7 白色固體，ESI-MSm/z:460［M］+。分子式C28H44O5。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:6.50(1H，s，H-7)，5.45(1H，dd，J=8.8，15.4 Hz，H-22)，5.34(1H，dd，J=8.8，15.4 Hz，H-23)，4.06(1H，m，H-3)，2.80(1H，m，H-15)，2.38(1H，m，H-20)，2.33(1H，ddd，J=4.0，13.9，13.9 Hz，H-1)，1.00(3H，s，H3-18)，1.00(3H，d，J=6.6 Hz，H3-21)，0.99(3H，s，H3-19)，0.95(3H，d，J=6.6 Hz，H3-28)，0.85(3H，d，J=6.6 Hz，H3-27)，0.83(3H，d，J=6.6 Hz，H3-26)。13C NMR(CDCl3，150MHz)δ:199.4(C-6)，166.9(C-8)，135.3(C-22)，132.9(C-23)，122.8(C-7)，84.6(C-14)，79.3(C-5)，75.9(C-9)，66.7(C-3)，56.1(C-17)，49.8(C-13)，43.3(C-24)，43.3(C-10)，41.9(C-15)，39.5(C-20)，38.1(C-4)，37.4(C-12)，33.4(C-25)，31.7(C-2)，28.6(C-16)，28.0(C-11)，26.0(C-1)，22.9(C-19)，20.4(C-21)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，17.9(C-28)，17.5(C-18)。其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物7 為3β，5α，9α，14β-tetrahydroxy-(22E)-ergosta-7，22-dien-6-one。

2.2 討論

化合物1，2，3 屬于結(jié)構(gòu)新穎的萜類化合物?；衔?，3 最初從植物中分離出來，這種verrucosane類的二萜在海綿中非常罕見。本文是第二次報(bào)道verrucosane 型二萜從海綿中分離出來，這為研究海洋生物與陸地生物生態(tài)學(xué)之間的關(guān)系提供了材料?；衔?，5，6 都為高度氧化的麥角甾醇衍生物，結(jié)構(gòu)較為新穎。在細(xì)胞毒活性篩選中，對(duì)首次從Halichondriasp.中分離出來7 個(gè)化合物進(jìn)行了活性評(píng)價(jià)，化合物1，3 對(duì)HeLa 顯示出了較弱的細(xì)胞毒活性，IC50值分別為33.7 和43.8 μM。

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