王風(fēng)巧，黨瑞華，黃潔萍，雷初朝，藍(lán)賢勇，陳 宏

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100）

Mx（myxovirμs resistance）基因是由 Lindenmann等［1］在一近交小鼠品系A(chǔ)2G小鼠中首次發(fā)現(xiàn)，因其能耐受對其它隨機(jī)交配小白鼠致死劑量的流感病毒感染而命名為Mx基因。Mx蛋白是一種由Ⅰ型（α／β）和Ⅲ型（λ）干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生具有 GTPase活性的抗病毒蛋白［2］。大多數(shù)脊椎動(dòng)物體內(nèi)有1～3個(gè)Mx蛋白的不同異構(gòu)體，一般定位于核內(nèi)或胞質(zhì)中。

Mx蛋白可在多種動(dòng)物的多種類型細(xì)胞中表達(dá)，對多種病毒具有抗性［3］。Mx蛋白已知對RNA病毒，如流感病毒、水皰性口炎病毒、托高土病毒和漢坦病毒等有抑制作用，甚至對DNA病毒也有一定的抑制作用，如乙型肝炎病毒［4］。RNA病毒的感染可以使牛Mx基因的m RNA和Mx蛋白質(zhì)表達(dá)水平上升［5］。所以，機(jī)體內(nèi)Mx蛋白表達(dá)水平的上升，也可作為機(jī)體感染病毒的特殊信號。與干擾素相比，Mx蛋白具有活性穩(wěn)定、特異性好、半衰期長、檢測方便以及抗病毒作用更直接的優(yōu)點(diǎn)。因此，對Mx基因及其編碼蛋白的研究和開發(fā)將有助于未來畜禽病毒感染狀況檢測及抗病育種工作。

牛的Mx1基因位于1號染色體上，含有15個(gè)外顯子，編碼648個(gè)氨基酸。目前關(guān)于牛Mx1基因多態(tài)性及抗病毒活性的研究主要集中在國外具有代表性的牛品種上，Mx1基因還包含2個(gè)剪接亞型Mx1B［6］和 Mx1a［7-8］。Nakatsu等［9］在5個(gè)代表性牛品種的Mx1 c DNAs中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)SNPs，構(gòu)建了11種主要單倍型，并在3＇-UTR發(fā)現(xiàn)一個(gè)13 bp的片段插入／缺失突變。另外，通過體外重組感染試驗(yàn)證明，牛Mx1基因具有抗傳染性水皰性口炎病毒（SVS）的活性，且不同的單堿基突變對病毒抗性有不同的影響。目前，對此基因新功能的挖掘尚在不斷研究中，例如是否和奶牛的乳房炎抗性相關(guān)等。本試驗(yàn)旨在通過分析陜西地區(qū)荷斯坦牛Mx1基因的多態(tài)性，為下一步調(diào)查其多態(tài)性與體細(xì)胞數(shù)的關(guān)聯(lián)性奠定基礎(chǔ)，也為將來Mx1基因在奶?？共∮N中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究從西安市農(nóng)業(yè)總公司牛一場采集226頭荷斯坦牛的毛發(fā)樣，從楊凌晟元荷斯坦牛場采集120頭荷斯坦牛的血樣，共346個(gè)荷斯坦牛樣品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 血樣DNA的提取采用常規(guī)的酚-氯仿法。毛發(fā)DNA提取步驟如下：①用滅菌鑷子取3～5根毛發(fā)，先將毛囊及毛干浸入75%的酒精清洗后，再用蒸餾水沖洗，避免所有潛在的污染，然后將清洗好帶毛囊的毛發(fā)，剪取5～8 mm帶毛囊的毛干放入200μL無菌離心管；②每個(gè)離心管中各加入100μL毛發(fā)裂解液和0.5μL蛋白酶K（20 mgom L-1）；③將離心管放入PCR儀中處理，PCR程序?yàn)椋?8℃30 min，75℃15 min，4℃5 min。提取好的DNA分裝后貯存在-20℃，以備DNA檢測、OD值檢測和PCR擴(kuò)增。毛發(fā)裂解液配制如下：250μL Tween20，5 m L 10×PCR buffer，5 m L MgCl2（25 m M），20μL CaCl2（10 m M），最后加蒸餾水至50 m L。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI（Gen-Bank登錄號：NW-003103824）提供的牛Mx1基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）有限公司合成。共設(shè)計(jì)15對引物（見表1）。

荷斯坦牛混合DNA池（每10個(gè)不同樣本混合成一個(gè)DNA池）為模板，進(jìn)行Mx1基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增總體積為36μL：1.5μL混合DNA池模 板 （10 ng／μL）、1.5μL 引 物 （10μmol／L）、18.75μL 2×Taq Master Mix（2×PCR緩沖液，3 m M MgCl2，1 U Taq DNA聚合酶和400μM d NTP混合物）、14.25μL dd H2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火（退火溫度見表1）40 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

表1 牛Mx1基因的引物信息Table 1 The information of primer sequences in bovine Mx1 gene

1.2.3 PCR-RFLP分析 利用DNA Star軟件對PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，篩選出SNPs位點(diǎn)，再采用PCR-RFLP方法對346頭荷斯坦奶牛的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。酶切體系包括：5μLPCR產(chǎn)物、9μL dd H2O、1μL buffer緩沖液、0.5μL（10 U／μL）限制性內(nèi)切酶，最適溫度消化過夜。酶切產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳或者8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，再通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄分型結(jié)果。

表2 PCR-RFLP引物及條件Table 2 PCR-RFLP primers and conditons

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用DNASTAR Lasergene軟件校對測序產(chǎn)物的原始序列；利用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對；利用SHEsis在線軟件計(jì)算基因頻率和基因型頻率，并進(jìn)行單倍型及頻率統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

本研究對陜西地區(qū)荷斯坦牛Mx1基因的14個(gè)外顯子進(jìn)行了多態(tài)性分析，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs，均為轉(zhuǎn)換，分別是外顯子3（g.843330 T＞C，g.843411 A＞G）、外顯子4（g.844048 C＞T）和外顯子7（g.851325 T＞C）。其中，外顯子3（g.843330 T＞C，g.843411 A＞G）和外顯子7（g.851325 T＞C）3個(gè)位點(diǎn)是錯(cuò)義突變，外顯子4（g.844048C＞T）位點(diǎn)是同義突變。氨基酸突變情況如表3所示。

4個(gè)SNPs位點(diǎn)依次選用限制性內(nèi)切酶HincII、AvaI、Scr FI和HaeIII進(jìn)行酶切分型。其中，外顯子3（g.843411 A＞G）、外顯子4（g.844048 C＞T）和外顯子7（g.851325 T＞C）三個(gè)位點(diǎn)為天然酶切位點(diǎn)，外顯子3（g.843330 T＞C）位點(diǎn)為創(chuàng)造性酶切位點(diǎn)。圖（1-2）僅顯示了外顯子3（g.843411 A＞G）和外顯子7（g.851325 T＞C）2個(gè)SNPs位點(diǎn)及其酶切分型多態(tài)性。4種酶切位點(diǎn)的分型統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。4個(gè)突變位點(diǎn)都存在三種基因型，但純合子的突變頻率較低。各個(gè)突變位點(diǎn)的基因型及其頻率如表5所示。4個(gè)SNPs位點(diǎn)共構(gòu)建了11種（H 1-H 11）單倍型（見表6），其中H 6為最主要的單倍型，頻率為0.362，H 4和H 7次之，其頻率分別為0.176和0.354。

表3 牛Mx1基因的氨基酸突變Table 3 The mutation of amino acid in bovine Mx1 gene

3 討 論

Mx基因不僅存在于脊椎動(dòng)物中，在非脊椎動(dòng)物鮑魚中也存在［10］，說明Mx基因廣泛存在于各種動(dòng)物體內(nèi)，對機(jī)體生存具有重要作用。在畜禽抗病育種實(shí)踐中，Mx蛋白和主要組織相容性復(fù)合體因具有抗病毒作用而備受抗病育種研究者的關(guān)注，在豬、禽群體中已廣泛調(diào)查了其多態(tài)性。張愛玲等［11］在豬Mx l基因內(nèi)含子1及外顯子2中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)SNPs；Takeya等［12］在豬的Mx1基因第14外顯子中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SNPs；Ko等［13-14］發(fā)現(xiàn)雞2032位點(diǎn)的單核苷酸突變導(dǎo)致絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，此時(shí)的Mx1蛋白才具有抗病毒活性。

表4 牛Mx1基因PCR-RFLP多態(tài)性Table 4 The PCR-RFLP polymorphism of bovine Mx1 gene

圖1 Mx1基因外顯子3（g.843411 A＞G）處SNP檢測和擴(kuò)增產(chǎn)物Ava I PCR-RFLP電泳分析M.50 bp Ladder；1，4.GG基因型；2.AG基因型；3.AA基因型Fig.1 The SNP detection and electrophoretic patterns of PCR products in exon 3（g.843411 A＞G）ofMx1 gene digested by Ava I endonucleaseM.50 bp Ladder；lanes1，4.GG genotype；lane 2.AG genotype；lane 3.AA genotype

圖2 Mx1基因外顯子7（g.851325 T＞C）處SNP檢測和Hae III PCR-RFLP電泳分析M.50 bp Ladder；1.CT基因型；2，3.TT基因型；4.CC基因型Fig.2 The SNP detection and electrophoretic patterns of PCR products in exon 7（g.851325 T＞C）ofMx1 gene digested by Hae III endonucleaseM.50bp Ladder；1.CT genotype；2，3.TT genotype；4.CC genotype

表5 牛Mx1基因的基因型及其頻率Table 5 Genotypes and genotype frequencies in bovine Mx1 gene

表6 牛Mx1基因的單倍型及其頻率Table 6 Haplotypes and haplotype frequencies in bovine Mx1 gene

在牛Mx基因研究上，目前相關(guān)報(bào)道較少，僅限于在國外牛品種中進(jìn)行的多態(tài)性調(diào)查及與傳染性水皰性口炎病毒的抗性相關(guān)研究。Nakatsu等［9］在5個(gè)代表性牛品種的Mx1 cDNAs中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)SNPs，其中10個(gè)同義突變，1個(gè)導(dǎo)致異亮氨酸（Ile）替換為甲硫氨酸（Met）的錯(cuò)義突變。此外，在3＇-UTR還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)13 bp的片段插入／缺失突變。Babiker等［15］在11個(gè)牛品種的Mx2 cDNAs中發(fā)現(xiàn)了17個(gè)SNPs，其中14個(gè)同義突變，2個(gè)引起甘氨酸（Gly）替換為絲氨酸（Ser）、異亮氨酸（Ile）替換為纈氨酸（Val）的錯(cuò)義突變，還有1個(gè)SNP位于3＇-UTR區(qū)。另外，Babiker等在水牛上也發(fā)現(xiàn)了46個(gè)SNPs，其中34個(gè)是同義突變，12個(gè)SNPs引起了氨基酸的替換。在水牛Mx2基因5＇-UTR區(qū)還發(fā)現(xiàn)一個(gè)9 bp的片段插入／缺失突變。本試驗(yàn)結(jié)果也表明在荷斯坦奶牛群體中，Mx1基因具有較豐富的多態(tài)性。Nakatsu等［9］和Babiker等［15］通過體外重組試驗(yàn)證明Mx1和Mx2基因具有很好的抗傳染性水皰性口炎病毒（VSV）的活性，且不同的單核苷酸突變和片段插入缺失突變對其抗病活性有不同的影響。本研究在346頭陜西地區(qū)荷斯坦奶牛Mx1基因的14個(gè)外顯子中共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)SNPs。其中，外顯子4（g.844048 C＞T）是同義突變；外顯子3（g.843330 T＞C，g.843411 A＞G）兩個(gè)位點(diǎn)的突變分別引起了異亮氨酸（Ile）向蘇氨酸（Thr）和谷氨酸（Glu）向精氨酸（Arg）的突變；外顯子7（g.851325 T＞C）位點(diǎn)的突變導(dǎo)致亮氨酸（Leu）向脯氨酸（Pro）的突變。氨基酸序列的改變將導(dǎo)致最終編碼蛋白構(gòu)象的變化，也意味著不同基因型個(gè)體在抗病毒活性方面可能存在差異，這些多態(tài)位點(diǎn)將是未來奶牛抗病育種選育需要關(guān)注的地方。本研究所發(fā)現(xiàn)的SNPs數(shù)量少于Nakatsu等［9］的發(fā)現(xiàn)，可能原因是因?yàn)楸狙芯恐贿x取了陜西地區(qū)荷斯坦奶牛的群體，品種單一，規(guī)模也較小，另外也只調(diào)查了編碼氨基酸的外顯子序列。本研究首次對陜西地區(qū)荷斯坦奶牛Mx1基因的14個(gè)外顯子進(jìn)行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性較豐富，這將有利于下一步調(diào)查其與奶牛體細(xì)胞數(shù)的關(guān)聯(lián)性，也將為未來荷斯坦奶牛抗病育種實(shí)踐提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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