富國(guó)文，王紹卿，滕曉紅，榮華，賈俊靜，樊月圓

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650201）

垂體特異轉(zhuǎn)錄因子（pituitary specific transcription 1，POU1F1）是動(dòng)物垂體前葉特異表達(dá)的一種具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的產(chǎn)物通過(guò)與垂體中PRL基因、GH基因、TSH基因以及POU 1F1自身的調(diào)控元件結(jié)合，調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育等起著重要的調(diào)控作用［1-2］。POU1F1由POU1F1基因編碼，是POU結(jié)構(gòu)域因子家族的一員。POU家族中成員大多具有一個(gè)POU特異區(qū)（POU-HD）和一個(gè)POU同源區(qū)（POU-SD）的DNA結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域能識(shí)別特異的基因序列并與之結(jié)合。從而引起細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)垂體前葉促生長(zhǎng)素細(xì)胞、催乳細(xì)胞和促甲狀腺素細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)活性［3］。在人上，POU1F1基因位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致人類的生長(zhǎng)發(fā)育異常，包括生長(zhǎng)緩慢及矮小等癥狀。同時(shí)GH、PRL和TSH-β缺乏的程度依賴于POU1F1基因的突變類型；在鼠上，已研究證實(shí)該基因與矮小性狀基因座存在緊密連鎖關(guān)系［4-7］。在家禽上，POU1F1基因位點(diǎn)的突變與其生長(zhǎng)性能相關(guān)性也被做了大量的研究［8-10］。

大圍山微型雞是云南省的優(yōu)良地方品種，主要分布在云南省紅河州屏邊苗族自治縣境內(nèi)大圍山自然保護(hù)區(qū)。該雞種具有較高的屠宰率和全凈膛率，產(chǎn)蛋率高，耗料少，飼料報(bào)酬率高等優(yōu)點(diǎn)。但是它個(gè)體小，成為其在生產(chǎn)上的致命缺點(diǎn)。如果能從分子水平上找出該品種體型較小的成因，無(wú)疑對(duì)改變其生長(zhǎng)狀況具有重要實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

來(lái)自云南武定縣的武定雞和大圍山的微型雞各5只。從翅下采血5 m L，于-80℃保存。

1.2 基因組DNA制備

血樣基因組DNA的提取用常規(guī)的酚-氯仿抽提法，提取后的DNA用TE緩沖液溶解后，經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)：參照GeneBank中提供的雞POU1F1基因的序列（登錄號(hào)：NC＿006088），利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物共6對(duì)，包括6個(gè)完整的外顯子區(qū)域，引物的合成及測(cè)序工作由華大基因技術(shù)有限公司完成。引物信息如下（表1）。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小、位置以及Tm值Table 1 The sequences of primers，length，location and Tm of each PCR product

15μL PCR反應(yīng)體系：10×Buffer（含15 m M Mg2＋）1.5μL，2 m M d NTPs 1.5μL，2 U／μL Taq DNA聚合酶0.25μL，5 M混合引物（上游引物和下游引物各為10 pmol／μL）0.6μL，模板DNA （50 ng／μL）1.0μL，dd H2O 10.15μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min；35個(gè)循環(huán)（94℃30s，Tm 30 s，72℃30 s）；72℃延伸10min，4℃保存。

1.4 POU1F1基因PCR產(chǎn)物的回收與測(cè)序

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增結(jié)果，并送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，使用軟件剪切拼接后獲得編碼區(qū)序列。

1.5 POU1F1基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)分析

圖1 POU1F1基因P1～P6引物的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of P1～P6 primers for POU1F1 geneM.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL2000；1，2.P1引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；3，4.P2引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；5，6.P3引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；7，8.P4引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；9，10.P5引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；11，12.P6引物的擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL2000；1，2.Product of P1；3，4.Product of P2；5，6.Product of P3；7，8.Product of P4；9，10.Product of P5；11，12.Product of P6

利用DNAstar軟件包中的EditSeq、GeneQuest和Meg Align對(duì)PUO1F1基因序列、ORF進(jìn)行分析；利用Protean軟件對(duì)POU1F1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)；從NCBI下載不同物種的POU1F1基因序列，利用DNAman和DNAstar軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及遺傳距離研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 POU1F1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

POU1F1基因各引物均得到特異性擴(kuò)增，如圖1所示。其中P1引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為1和2號(hào)樣品，擴(kuò)增片段大小為245 bp；P2引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為3和4號(hào)樣品，擴(kuò)增片段大小為286 bp；P3引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為5和6號(hào)樣品，擴(kuò)增片段大小為318 bp；P4引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為7和8號(hào)樣品，擴(kuò)增片段大小為269 bp；P5引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為9和10號(hào)樣品，擴(kuò)增片段大小為208 bp；P6引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為11和12號(hào)樣品，擴(kuò)增片段大小為245 bp。

2.2 大圍山微型雞編碼區(qū)的序列分析

利用DNAstar軟件對(duì)6對(duì)引物的測(cè)序結(jié)果與Gallus gallus（NM＿204319）進(jìn)行了比對(duì)，手工剪接后得到了全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為984 bp，武定雞POU1F1基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)也為984 bp。與Gallus gallus（NM＿204319）進(jìn)行了比較，在檢測(cè)的個(gè)體中，大圍山微型雞在編碼區(qū)的836 bp處發(fā)生了一個(gè)C／T的單堿基突變，該突變未引起279位Ile變異。利用EditSeq和GeneQuest軟件，對(duì)大圍山微型雞POU1F1基因的編碼區(qū)的核苷酸組成進(jìn)行分析，其中核苷酸A、C、G和T分別為287、238、229和230個(gè)。

2.3 POU1F1基因的開(kāi)放閱讀框分析

本研究將大圍山微型雞編碼區(qū)序列通過(guò)Edit-Seq軟件進(jìn)行分析，獲得了一條長(zhǎng)456 bp的ORF（圖2），該ORF起始密碼子位于±1，終止密碼子位于±984，推測(cè)大圍山微型雞POU1F1基因可編碼1個(gè)由327個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

圖2 大圍山微型雞POU1F1基因ORF序列及其編碼氨基酸序列Fig.2 The ORF sequence and encoded amino acid sequence of POU1F1 gene of Daweishan mini chickens

2.4 POU1F1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

用Bioedit及Protean軟件對(duì)POU1F1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，POU1F1基因編碼327個(gè)氨基酸，其中絲氨酸（Ser）和亮氨酸（Leu）所占比例最高，分別達(dá)到了12.23%和9.17%（圖3）；推測(cè)該編碼產(chǎn)物在p H 7.0環(huán)境下的電荷量為9.81，理論等電點(diǎn)為 8.67，理論分子質(zhì)量為38801.19 Da.

根據(jù)Protean結(jié)果，POU1F1基因的編碼產(chǎn)物的疏水性在多肽鏈第12位纈氨酸具有最低的分值（-2.14），在第250位的精氨酸具有最高的分值（3.72），且推斷整條多肽鏈氨基酸序列表現(xiàn)為親水性而沒(méi)有明顯的疏水性區(qū)域。

2.5 大圍山微型雞與其他物種POU1F1基因核苷酸序列同源性分析

將NCBI上不同物種的POU1F1基因核苷酸序列（牛：NM＿174579，家犬：XM＿005638736，山羊：NM＿001285673，野鴿：XM＿005511429，原雞：NM＿204319，人：NM＿001122757，獼猴：NM＿001042860，家鼠：NM＿008849，綿羊：NM＿001009350，褐家鼠：NM＿013008，野豬：NM＿214163）與本研究所獲取的大圍山微型雞以及武定雞的POU1F1基因的核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比，利用Meg Align軟件分析了這13條核苷酸序列的同源性（表2）并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。結(jié)果表明，原雞、武定雞以及大圍山微型雞與其它10個(gè)物種POU1F1基因的核苷酸相似性從23.6～26.9，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列的氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of coding DNA sequences of POU1F1 gene of Daweishan mini chickens

表2 不同物種POU1F1基因的遺傳距離Table 2 The sequence distance base on the POU1F1 gene of different species

3 討 論

1992年，在家禽中，火雞的POU1F1基因首先被Wong等所克隆?？寺〗Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，火雞的POU1F1基因與哺乳動(dòng)物類似，存在三種POU1F1m RNA，分別為t POU1F1＊，t POU1F1β＊ 和t POU1F1w＊［11］；Kurima等［12］1998 年 研 究發(fā)現(xiàn)，三種POU1F1 m RNA中t POU1F1＊表達(dá)量最高，t POU1F1β＊表達(dá)量最低。Tanaka等［13］1999年從雞的垂體中克隆了編碼325和327氨基酸的兩種POU1F1m RNA，分別為c POU1F1α和c POU1F1γ。研究表明，POU1F1基因的正常表達(dá)是垂體前葉正常發(fā)育及激素正常分泌的必要條件。POU1F1基因突變可能造成人和鼠復(fù)合性垂體激素缺乏癥。姜潤(rùn)澤［14］研究表明，POU 1 F 1基因第六外顯子處（299Asn→Ile）的突變與雞（尤其是公雞）早期生長(zhǎng)速度顯著相關(guān)（P＜0.05）；邱峰芳等［15］研究表明，POU1F1基因與雞的1～7周齡體重極顯著相關(guān)（P＜0.01），與8周齡體重顯著相關(guān)（P＜0.05）；陶勇等［16］在POU1F1基因型檢測(cè)到一個(gè) A→T突變，雜合型個(gè)體體重顯著高于純合型個(gè)體。

圖4 不同物種POU1F1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogentic tree base on the POU1F1 gene of different species

本研究通過(guò)對(duì)云南地方品種-大圍山微型雞的POU1F1基因6個(gè)克隆片段進(jìn)行拼接后得到了大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列，該序列為包括終止密碼子在內(nèi)的完整的編碼區(qū)序列，序列長(zhǎng)度為984 bp，編碼有327個(gè)氨基酸殘基。朱志明等［17］對(duì)半番鴨的POU1F1基因進(jìn)行克隆，獲得了完整的cDNA序列，全長(zhǎng)為2 209 bp，與雞的氨基酸序列同源性達(dá)到了96.3%。本研究對(duì)牛、家犬、山羊、野鴿、原雞、人、獼猴、家鼠、綿羊、褐家鼠、野豬、大圍山微型雞和武定雞的核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，家禽與哺乳動(dòng)物有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，核苷酸相似性從23.6～26.9，這與家禽POU1F1序列的特殊性有關(guān)。對(duì)于家禽而言，禽類POU1F1存在一個(gè)由38個(gè)氨基酸組成的肽段，該肽段是禽類所特有的，位于相當(dāng)于哺乳動(dòng)物外顯子2、3之間，將其命名為外顯子2a。從遺傳距離分析及基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，我們也發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系較近先聚在一起，如：牛、山羊及綿羊最先聚在一起，核苷酸相似性達(dá)到97.6%以上，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)基本相符。同時(shí)在原雞、武定雞以及大圍山微型雞的POU1F1基因編碼區(qū)序列比對(duì)中，在大圍山微型雞的836bp處發(fā)生了一個(gè)C／T的單堿基突變，雖然在核苷酸水平上有一些差異，但屬于同義突變，并不影響編碼蛋白的結(jié)構(gòu)組成。

本研究所獲得的大圍山微型雞的完整的POU1F1編碼區(qū)序列，為以后研究POU1F1基因與大圍山微型雞經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析提供了基礎(chǔ)，也為研究大圍山微型雞體型矮小的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，下一步研究將在增大樣本量后，從多個(gè)角度全面地揭示其遺傳特性。

［1］ 姜潤(rùn)深，楊 寧.垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子POU1F1研究進(jìn)展［J］.遺傳，2004，26（6）：957-961.

［2］ Steinfelder H L，Radovick S.Hormonal regulation of the thyrotropin subunit gene by phosphorylation of the pituitary specific transcription factor（PIT-Ⅰ）［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1992，89：5 942-5 945.

［3］ Ll S，Crenshaw EB，Rawsen E J，el a1.Dwarf locus mutants lacking three pituitary cell types result from mutations in the POU-domain gene Pit-1［J］.Nature，1990，347：528-533.

［4］ Frisch H，Kim C，Hausler G，et a1.Combined Pituitary hormone deficiency and Pituitary hypoplasia due to a mutation of the POUIFl gene［J］.Clin Endocfinol（Oxf），2000，52：661-665.

［5］ Steinfelder H J，Radovick S，Wondisford F E.Hormonal regulation of the thyrotrophicβ-subunit gene by phosphorylation of the pituitary specific transcription factor Pit-1［J］.Proceedings of the National Academy of Science，1992，89：5 942-5 945.

［6］ Li S，Crenshaw E B，Rawson E J，et al.Dwarf locus mutants lacking three pituitary cell types result from mutations in the POU-domain gene Pit-1［J］.Nature，1990，347（6293）：528-533.

［7］ Pellegrini-Bouiller I，Belicar P，Barlier A，et al.A new mutation of the gene encoding the transcription factor Pit-1 is responsible for combined pituitary hormone deficiency ［J］.J Clin Endocrinol Metab，1996，81（8）：2 790-2 796.

［8］ 李國(guó)輝，張學(xué)余，蘇一軍，等.3個(gè)基因SNPs及基因聚合對(duì)白耳雞產(chǎn)蛋數(shù)的遺傳效應(yīng)［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（4）：661-667.

［9］ 李國(guó)輝，魏 岳，張學(xué)余，等.雞GH和POU1F1基因多態(tài)性及基因聚合對(duì)產(chǎn)蛋數(shù)的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，36（4）：445-448.

［10］ 楊 孔，楊艾琳，吳夢(mèng)玲.藏雞FSH、POU1F1和FSHR的基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，40（1）：1-10.

［11］ Wong E，Silsby L，Halawani M E.Complementary DNA cloning and expression of Pit-I／GHF-l from the domestic turkey［J］.DNA Cell Bio1，1992，11：65l-660.

［12］ Kurima K，Weatherly K L，Sharova L，et al.Synthesis of turkey POUIFl mRNA variants by alternative splicing and transcription initiation［J］.DNA Cell Bio1，1998，17：93-103.

［13］ Tanaka M，Yammnoto l，Ohkubo T，et a1.cDNA cloning and developmental alterations in gene expression of the two POUIFI／GHF-l transcription factors in the chicken pituitary［J］.Gen Comp Endocrinol，1999，114：441-448.

［14］ 姜潤(rùn)深.雞PRL、PRLR和POU1F1基因變異對(duì)繁殖及POU1F1對(duì)生長(zhǎng)性狀的遺傳效應(yīng)［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［15］ 邱峰芳，聶慶華，金衛(wèi)根，等.雞PIT-Ⅰ基因57 bp插入／缺失多態(tài)與生長(zhǎng)和屠體性狀的相關(guān)研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28（2）：284-288.

［16］ 陶 勇，李國(guó)輝，胡玉萍，等.MC4R、POU1F1基因?qū)┖｜S雞生長(zhǎng)性能的遺傳效應(yīng)［J］.遺傳，2008，7，30（7）：900-906.

［17］ 朱志明，陳 暉，李盛霖，等.半番鴨POU1F1基因序列的克隆與生物信息學(xué)分析［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2010，32（1）：1-4.