劉云霄，潘曉瓊，胡臻

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325027）

藤茶作為一種民間古茶，可追溯至東晉時(shí)期[1]。目前，在我國(guó)廣大農(nóng)村，甚至在東南亞各國(guó)也享有盛譽(yù)。民間主要用以治療糖尿病等多種疾病。現(xiàn)代研究表明，藤茶中主要含有黃酮類成分，以二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）含量最高，具有消炎抗菌、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、保肝[4]、護(hù)胃[5]、降血糖[6]等作用。糖尿病以高血糖為主要特征，逐漸損傷血管和器官，最終出現(xiàn)威脅生命的并發(fā)癥。在這些并發(fā)癥的病理生理中，微小血管的改變起到十分重要的作用[7]。以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)DMY具有降血糖、抗氧化作用，但缺乏對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)HUVECs為基礎(chǔ)，通過(guò)觀察DMY對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用，明確DMY對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和試劑：HUVECs由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。胎牛血清、PRMI1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶-EDTA為Gibco公司產(chǎn)品，青/鏈霉素、活性氧（ROS）、細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）、細(xì)胞凋亡-Hoechst33258染色試劑盒購(gòu)于碧云天，MTT為sigma公司產(chǎn)品，DMY購(gòu)于成都曼思特公司，D-葡萄糖為biosharp公司產(chǎn)品，超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、微量丙二醛（MDA）測(cè)試盒購(gòu)于南京建成。

1.1.2 儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，多功能酶標(biāo)儀，細(xì)胞工作超凈臺(tái)，低速離心機(jī)，倒置顯微鏡，流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株的培養(yǎng)：HUVECs復(fù)蘇后，用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，隔天傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于本次實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：用不同濃度DMY（5μg·mL-1，20μg·mL-1，80μg·mL-1）預(yù)處理保護(hù)HUVECs 12 h，分別為DMY低、中、高劑量組，再用0.5 mmol·L-1H2O2[8]干預(yù)12 h后進(jìn)行相應(yīng)的處理。

1.2.3 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化：按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4 取上清液檢測(cè)SOD、MDA：按說(shuō)明書操作，分別于多功能酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為550 nm、532 nm處，測(cè)各管SOD、MDA吸光度。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化情況：分別按試劑盒說(shuō)明書處理后，避光保存，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以 ±s表示，采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理因素對(duì)HUVECs活力的影響 與正常組相比，每組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DMY濃度與HUVECs細(xì)胞活性呈負(fù)相關(guān)，以5μg·mL-1保護(hù)作用最明顯。DMY 80μg·mL-1時(shí)細(xì)胞活力反低于H2O2組，可能與細(xì)胞不能耐受高濃度的DMY及高濃度存在細(xì)胞毒性有關(guān)。見表1。

表1 不同處理因素對(duì)HUVECs活力的影響（n=15，±s）

2.2 Hoechst33258進(jìn)行細(xì)胞核染色 正常HUVECs核呈彌散均勻低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，胞核較大，形態(tài)規(guī)則，呈圓形或者橢圓形狀。H2O2組細(xì)胞核呈集中高強(qiáng)度藍(lán)色熒光，偶有些顏色發(fā)白，胞核較小，形態(tài)不規(guī)則，呈固縮致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。DMY（低、中、高劑量）組細(xì)胞核熒光強(qiáng)度隨濃度增加而增加，胞核由低強(qiáng)度逐漸趨于高強(qiáng)度熒光，形狀由規(guī)則圓形或者橢圓形逐漸呈不規(guī)則固縮致密濃染化，細(xì)胞數(shù)逐漸減少，見圖1。以上表明，DMY對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs損傷起保護(hù)作用，且呈劑量負(fù)相關(guān)性，其最佳藥物濃度為5μg·mL-1。

2.3 DMY組能顯著增加上清液SOD活性，降低MDA含量 與正常組相比，H2O2誘導(dǎo)HUVECs出現(xiàn)SOD活性下降，MDA含量升高，引起氧化損傷。DMY增強(qiáng)清除自由基的能力，減少過(guò)氧化作用的發(fā)生，增強(qiáng)抗氧化能力，從而起保護(hù)細(xì)胞的作用，以5μg·mL-1DMY低劑量組尤為明顯。見表2。

圖1 不同濃度DMY對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞核形態(tài)學(xué)比較（×400）

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+濃度 與正常組相比，H2O2引起HUVECs出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca2+積累，兩者呈正相關(guān)性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。DMY為強(qiáng)抗氧劑，DCFH-DA探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS反應(yīng)較為敏感，故DMY（低、中、高劑量）組ROS量與DMY濃度呈正相關(guān)，DMY（低、中、高劑量）組ROS量反低于正常組。與正常組相比，DMY（中、高劑量）組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但ROS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故DMY（中、高劑量）組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傊?，DMY低劑量組，能顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和Ca2+濃度，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），故DMY低劑量組對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞起最佳保護(hù)作用。見表3。

表2 DMY對(duì)細(xì)胞上清液SOD活性和MDA含量的影響（n=15，±s）

表3 DMY對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS和Ca+濃度的影響（n=15，±s）

3 討論

目前全球糖尿病患病率呈明顯上升趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)5.52億。此外，在全球范圍內(nèi)有糖尿病前兆、糖耐量受損、胰島β細(xì)胞功能失調(diào)人群，到2030年將達(dá)3.98億。目前認(rèn)為糖尿病及其并發(fā)癥潛在的發(fā)生機(jī)制主要為氧化應(yīng)激，內(nèi)皮功能紊亂而引發(fā)糖尿病誘導(dǎo)血管性的疾病。研究表明內(nèi)皮功能紊亂往往先于糖尿病臨床癥狀出現(xiàn)[9-10]。糖尿病對(duì)微小血管的損傷導(dǎo)致血管硬化損傷是不可逆的。因此，通過(guò)早期診斷和優(yōu)化血糖控制以預(yù)防微小血管的損傷，減少并發(fā)癥[11]有著非常重要的作用。

SOD是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化物酶，在人體內(nèi)將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化成H2O2，從而減少超氧陰離子與一氧化氮反應(yīng)生成有活性的過(guò)氧硝酸鹽的可能性[12]，可間接反映細(xì)胞內(nèi)的抗氧化水平的情況。MDA是細(xì)胞內(nèi)自由基作用于多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)后的產(chǎn)物，可間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平的情況[13]。由于SOD和MDA都是氧化損傷在不同層次上的反應(yīng)，他們之間的表現(xiàn)有一致性。

ROS在糖尿病的發(fā)病和血管功能障礙的發(fā)展中扮演重要的角色。在糖尿病并發(fā)癥的靶細(xì)胞里發(fā)現(xiàn)線粒體ROS生成增加[14]。而細(xì)胞內(nèi)的Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，鈣穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞正常存在的基礎(chǔ)。本研究使用H2O2模擬糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，H2O2具有強(qiáng)氧化性，低濃度可導(dǎo)致正常細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，高濃度則出現(xiàn)壞死。H2O2引起細(xì)胞損傷的關(guān)鍵在于通過(guò)Ca2+作為第二信號(hào)，引發(fā)一系列細(xì)胞程序化死亡的信號(hào)傳導(dǎo)。ROS對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+有一定的調(diào)控作用。當(dāng)Ca2+濃度升高超過(guò)正常細(xì)胞內(nèi)Ca2+的閾值，Ca2+濃度升高可促進(jìn)胞內(nèi)ROS堆積，反之亦然，兩者在細(xì)胞凋亡中起重要作用。

氧化應(yīng)激的預(yù)防機(jī)制，有助于減少ROS的代謝產(chǎn)物及其衍生物的形成，包括SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）和過(guò)氧化氫酶（CAT）等。這些抗氧化酶水平影響各種組織氧化應(yīng)激的敏感性和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。糖尿病的發(fā)生會(huì)增加脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的敏感性，這是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的形成的重要原因。DMY是一種具有抗氧化、抗感染等功效的黃酮類化合物。目前鮮有有關(guān)從細(xì)胞學(xué)角度出發(fā)探討DMY對(duì)糖尿病的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究DMY對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制，證實(shí)DMY能增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性，降低MDA含量，通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS、Ca2+從而對(duì)HUVECs起保護(hù)作用，以低濃度5μg·mL-1DMY時(shí)效果最佳。關(guān)于其最佳保護(hù)藥物濃度，筆者認(rèn)為濃度越高，超過(guò)細(xì)胞本身負(fù)荷的能力，反造成細(xì)胞代謝的負(fù)擔(dān)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。不同于DMY對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，出現(xiàn)劑量依賴性，濃度越高，抗腫瘤越強(qiáng)[15]。

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