翟曉巧，張曉申，范國(guó)強(qiáng)，趙振利，曹喜兵

（1. 河南省林業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450003； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 泡桐研究所，河南 鄭州 450002）

毛泡桐二倍體及其同源四倍體的AFLP和MSAP分析

翟曉巧1,2，張曉申2，范國(guó)強(qiáng)2，趙振利2，曹喜兵2

（1. 河南省林業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450003； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 泡桐研究所，河南 鄭州 450002）

分別用AFLP和MSAP分子標(biāo)記技術(shù)，研究了毛泡桐二倍體及其同源四倍體幼苗DNA堿基序列及其甲基化的變化。結(jié)果表明，毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA堿基序列在AFLP水平上沒有發(fā)生變化；在MSAP擴(kuò)增電泳凝膠上，毛泡桐二倍體及其同源四倍體分別檢測(cè)到2 262和2 180個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，DNA甲基化位點(diǎn)占總擴(kuò)增位點(diǎn)的比例分別為35.32%和38.58%，其中DNA全甲基化比例則為12.86%和14.13%；毛泡桐同源四倍體DNA甲基化和去甲基化頻率高于其二倍體，總DNA甲基化多態(tài)性低于二倍體。

毛泡桐；二倍體；同源四倍體；DNA甲基化；AFLP；MSAP

在植物進(jìn)化過程中，多倍化是植物適應(yīng)環(huán)境的一種表現(xiàn)形式。自然界大約70%的被子植物在進(jìn)化史中經(jīng)歷過一次或一次以上的多倍化事件[1]。植物多倍化后，因染色體數(shù)目增多，基因的劑量效應(yīng)和互作效應(yīng)會(huì)引起植物一系列生理生化代謝活動(dòng)的改變，最終在形態(tài)特征等方面表現(xiàn)出差異[2-3]。植物多倍化過程中，一方面染色體結(jié)構(gòu)[4-7]和基因表達(dá)模式發(fā)生了變化[8-11]，另一方面DNA甲基化也發(fā)生了變化[12-14]。DNA甲基化通過DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性、DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等的改變，從而控制基因的表達(dá)[15-17]。泡桐Paulownia spp.是我國(guó)重要的速生用材和綠化樹種之一，在生態(tài)環(huán)境改善、緩解目前我國(guó)木材短缺局面和提高農(nóng)民生活水平等方面發(fā)揮著重要作用，但因其種質(zhì)資源匱乏、遺傳背景窄等原因造成現(xiàn)有二倍體泡桐品種存在叢枝病發(fā)生嚴(yán)重和“低干大冠”等問題，嚴(yán)重影響了泡桐效益的發(fā)揮。近年來,四倍體泡桐新種質(zhì)的成功誘導(dǎo)[18-23]，一方面擴(kuò)大了其遺傳背景，另一方面也為篩選泡桐新品種提供了材料支撐。為了解二倍體及其同源四倍體泡桐遺傳差異及DNA甲基化的作用，利用AFLP和MSAP分子標(biāo)記技術(shù)，開展了毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA堿基序列及其甲基化變化研究工作，以期闡明四倍體泡桐優(yōu)良特性的分子機(jī)理，為四倍體泡桐的大面積推廣提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所林木生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)30 d 的二倍體毛泡桐Paulownia tomentosa及其同源四倍體毛泡桐組織培養(yǎng)苗。剪取適量生長(zhǎng)狀況良好、大小一致、長(zhǎng)約0.5 cm的幼苗頂芽，用液氮速凍后放于-86℃冰箱內(nèi)備用。組培苗培養(yǎng)條件為溫度（25±2）℃、光照強(qiáng)度130 μmol·m-2s-1、光照時(shí)間 16 h·d-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 泡桐DNA的提取

毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的提取方法參照文獻(xiàn)[24]。

1.2.2 泡桐AFLP和MSAP分析

毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的AFLP和MSAP擴(kuò)增所需的96對(duì)引物組合的堿基序列和擴(kuò)增過程及其產(chǎn)物的電泳分析方法分別參照文獻(xiàn)[25-26]。

1.2.3 電泳凝膠的譜帶分析

AFLP和MSAP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)束、凝膠顯影后，先在UMAX PowerLook 2100XL型掃描儀掃描成像，再分別統(tǒng)計(jì)分析不同MMS濃度處理樣品間AFLP和MSAP凝膠譜帶的變化。對(duì)MSAP凝膠譜帶來說，H和M分別為EcoRⅠ/ HpaⅡ和EcoRⅠ/ MspⅠ雙酶切產(chǎn)物電泳譜帶。每一條譜帶代表一個(gè)酶切位點(diǎn)。將譜帶有或無分別記作“1”或“0”。 每個(gè)DNA樣品的H和M擴(kuò)增譜帶可劃分為4 種[種類I(H，M= 1，1)，無甲基化發(fā)生；種類Ⅱ(H，M =1，0)，單鏈 DNA外甲基化；種類Ⅲ(H，M =0，1)，雙鏈 DNA內(nèi)甲基化；種類IV(H，M =0，0)，雙鏈DNA外甲基化]。DNA甲基化類型分為多態(tài)性和單態(tài)性類型。DNA多態(tài)性類型包括：A(甲基化) 型、B(去甲基化) 型和C(不定) 型。其中，A型中的A1和A2代表DNA重新甲基化(對(duì)照樣H和M泳道均有帶，而處理樣僅H或M泳道有帶)，A3和A4代表DNA超甲基化(對(duì)照樣僅H或M有一條帶，而處理樣H和M泳道都沒帶)。B型（Bl、B2、B3和 B4）代表DNA去甲基化，DNA甲基化譜帶與A型相反。C型代表DNA甲基化的不確定性（對(duì)照樣與處理樣DNA甲基化差異譜帶無法確定）。單態(tài)性類型為D型（二倍體與四倍體間DNA譜帶相同）。同時(shí)，計(jì)算樣品的總DNA甲基化水平[（種類II + 種類Ⅲ）/（種類I + 種類II + 種類III）×100%]和總DNA甲基化多態(tài)性[（A+B+C）/（A+B+C+D）×100%]及DNA單態(tài)性[D/（A+B+C+D）×100%]。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的AFLP分析

由毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的AFLP擴(kuò)增結(jié)果（見圖1）可以看出，毛泡桐二倍體及其四倍體DNA的AFLP酶切位點(diǎn)相同。盡管同源四倍體毛泡桐與其二倍體的DNA經(jīng)不同引物AFLP擴(kuò)增后，產(chǎn)生片段的大小和數(shù)量存在一定的差異，但是經(jīng)同一引物擴(kuò)增后產(chǎn)生了數(shù)量相同和長(zhǎng)度一致的DNA片段。也就是說，毛泡桐二倍體染色體加倍前后DNA堿基序列在AFLP水平上沒有發(fā)生變化。

圖1 毛泡桐二倍體及其同源四倍體AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物的部分SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of partial AFLP amplif i cation products of diploid and tetraploid P. tomentosa

2.2 毛泡桐二倍體及其同源四倍體基因組DNA甲基化變化

2.2.1 毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA

甲基化水平變化

毛泡桐二倍體及其同源四倍體MSAP的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果（見表1）表明，毛泡桐同源四倍體的DNA甲基化水平高于其二倍體。毛泡桐二倍體DNA的MSAP擴(kuò)增出2 262個(gè)位點(diǎn)數(shù)，其中全甲基化位點(diǎn)數(shù)為291個(gè)（占總擴(kuò)增帶數(shù)的12.86%），半甲基化位點(diǎn)數(shù)為498個(gè)（占總擴(kuò)增位點(diǎn)的22.02%），總甲基化位點(diǎn)為799個(gè)（占總擴(kuò)增帶數(shù)的35.32%）；毛泡桐同源四倍體DNA的MSAP擴(kuò)增出2 180個(gè)位點(diǎn)數(shù)，其中DNA全甲基化位點(diǎn)數(shù)為308個(gè)（占總擴(kuò)增帶數(shù)的14.13%），半甲基化位點(diǎn)數(shù)為533個(gè)（占總擴(kuò)增位點(diǎn)的24.45%），總甲基化位點(diǎn)為841個(gè)（占總擴(kuò)增帶數(shù)的38.58%）。毛泡桐二倍體及其同源四倍體的DNA甲基化位點(diǎn)均以雙鏈全甲基化為主，并且同源四倍體DNA全甲基化和半甲基化水平高于其二倍體。

表1 毛泡桐二倍體及其同源四倍體基因組DNA甲基化水平的變化Table 1 DNA methylation levels between diploid and autotetraploid P. tomentosa

2.2.2 毛泡桐二倍體及其同源四倍體基因組DNA甲基化模式的變化

由毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA的MSAP擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳譜帶及其分析結(jié)果（見圖2、表2和表3）可以看出，毛泡桐二倍體DNA甲基化(A 型)位點(diǎn)數(shù)分別為335，占總甲基化多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的17.10%；去甲基化（B 型）位點(diǎn)數(shù)分別為372，占總甲基化多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)的18.99%；其中，與毛泡桐二倍體相比，同源四倍體毛泡桐的DNA總甲基化多態(tài)性為 36.60%，單態(tài)性為63.40% 。同源四倍體毛泡桐的DNA甲基化和去甲基化頻率高于其二倍體，總DNA甲基化多態(tài)性小于其二倍體。

圖2 毛泡桐二倍體及其同源四倍體基因組DNA甲基化模式變化Fig.2 DNA methylation patterns of diploid and tetraploid P. tomentosa

表2 毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA甲基化模式變化Table 2 Changes of DNA methylation patterns between diploid and autotetraploid P. tomentosa

表3 毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA甲基化狀態(tài)變化Table 3 Changes of DNA methylation status between diploid and autotetraploid P. tomentosa

3 討 論

植物同源四倍體是其二倍體染色體加倍后形成的新種質(zhì)，在解決染色體加倍帶來的核質(zhì)平衡問題后，才能適應(yīng)環(huán)境條件，完成其生活史。同源四倍體與其二倍體在形態(tài)特征等方面存在明顯差異，產(chǎn)生這些差異的根本原因在于四倍體發(fā)生了基因表達(dá)水平的差異。有關(guān)植物二倍體及其同源四倍體DNA堿基序列上的差異，不同研究者得出的結(jié)論也不完全相同。焦鋒等[27]和林強(qiáng)等[28]分別用RAPD分析了桑樹二倍體及其同源四倍體的DNA 指紋后沒有發(fā)現(xiàn)差異條帶；聶麗娟等[29]利用AFLP沒有檢測(cè)到西瓜二倍體及其同源四倍體DNA堿基序列間的變化；土豆染色體加倍前后DNA堿基序列也沒有發(fā)生變化[30]。然而，劉文革等[31]和王卓偉等[32]分別利用AFLP比較西瓜和桑樹二倍體與其同源四倍體的結(jié)果表明，二者的DNA 堿基序列則發(fā)生了一定程度的改變。黃瓜二倍體及其同源四倍體的研究結(jié)果也是如此[33]。本試驗(yàn)中，利用AFLP分析發(fā)現(xiàn)，毛泡桐二倍體及其染色體加倍后的DNA堿基序列沒有發(fā)生變化。該結(jié)果的出現(xiàn)可能與毛泡桐四倍體泡桐誘導(dǎo)過程中秋水仙堿用量較小、沒有引起染色體重疊、不等交換及突變等有一定關(guān)系。植物染色體加倍后，植株細(xì)胞內(nèi)因核質(zhì)不平衡等事件的發(fā)生，染色體結(jié)構(gòu)等必然會(huì)作出適當(dāng)調(diào)整；此外，環(huán)境還迫使植物作出適宜的形態(tài)變化以適應(yīng)周圍溫度、光照等條件，從而發(fā)生基因表達(dá)水平和表觀遺傳學(xué)變化[34-42]。因此，用MSAP技術(shù)就很容易檢測(cè)出染色體加倍后DNA甲基化的變化情況[43-46]。在此需要說明的是，因AFLP檢測(cè)的是DNA片段，故要證明毛泡桐二倍體及其同源四倍體DNA堿基序列是否相同，還需開展DNA單堿基（SNP）水平的研究工作。

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Analysis of diploid and its autotetraploid Paulownia tomentosa with AFLP and MSAP

ZHAI Xiao-qiao1,2, ZHANG Xiao-shen2, FAN Guo-qiang2, ZHAO Zhen-li2, CAO Xi-bing2
(1. Henan Academy of Forestry, Zhengzhou 450008, Henan, China; 2. Institute of Paulownia, Henan Agricultutral University, Zhengzhou 450002, Henan, China)

DNA base sequence and DNA methylation of diploid and autotetraploid Paulownia tomentosa seedlings were investigated with amplif i ed fragment length polymorphism (AFLP) and the methylation-sensitive amplif i cation polymorphism (MSAP) respectively.The results show that there was no change of their DNA base sequences between diploid Paulownia tomentosa and its autotetraploid;there were 2 262 and 2 180 sites were detected in the diploid and its autotetraploid by MSAP, and their methylation sites were 35.32%and 38.58% (where fully methylation rate were 12.86% and 14.13%) respectively; DNA methylation and demethylation levels of the autotetraploid Paulownia tomentosa were higher than those of its corresponding diploid, but its total DNA polymorphism was low than the diploid.

Paulownia tomentosa; diploid; autotetraploid; DNA methylation; AFLP; MSAP

S792.43; Q943

A

1673-923X(2014)01-0089-05

2013-08-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1204309，30271082，30571496）；河南省杰出人才計(jì)劃項(xiàng)目(122101110700)

翟曉巧（1971-），女，河南宜陽人， 研究員，博士，主要從事林木遺傳育種與生物技術(shù)研究；E-mail：user7117@163.com

范國(guó)強(qiáng)（1964-）,男，河南禹州人，教授，博士，主要從事泡桐豐產(chǎn)栽培理論與生物技術(shù)研究；

E-mail：gqfan@henau.edu.cn

[本文編校：謝榮秀]