文亞峰，韓文軍，周 宏

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2. 廣東省韶關(guān)市林業(yè)局，廣東 韶關(guān) 512000)

杉木Cunninghamia lanceolata是我國南方重要的用材林樹種，具有生長快、產(chǎn)量高、材質(zhì)好、用途廣等特點(diǎn)。但杉木分子遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)非常薄弱，嚴(yán)重滯后于楊樹、桉樹、松樹等其他用材林樹種。就分子標(biāo)記開發(fā)而言，目前杉木研究所用的標(biāo)記類型仍以RAPD[1]、ISSR[2]、AFLP[3]等顯性標(biāo)記為主，微衛(wèi)星（SSR）標(biāo)記開發(fā)數(shù)量極為有限[4-5]，阻礙了杉木分子遺傳學(xué)研究的發(fā)展。共顯性標(biāo)記位點(diǎn)的開發(fā)將對杉木分子遺傳學(xué)研究產(chǎn)生很大促進(jìn)作用。

與核基因組DNA相比，葉綠體基因組呈單親遺傳，保守性強(qiáng)，具有分子量小、多拷貝和結(jié)構(gòu)簡單等特點(diǎn)[6]?；诙毯塑账嶂貜?fù)序列而開發(fā)的葉綠體微衛(wèi)星（cp-SSR）是一種新型標(biāo)記技術(shù)，不僅具有SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，而且兼顧葉綠體基因組的特點(diǎn)，可用于植物群體遺傳分析、系統(tǒng)發(fā)育和細(xì)胞質(zhì)遺傳分析等[7-9]。杉木葉綠體基因組呈母性遺傳方式[10]，葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記還可為杉木優(yōu)良種子來源、母本繁殖、種子基因流檢測等提供強(qiáng)有力的技術(shù)手段。本文中以選自黑松和日本柳杉等的21個(gè)葉綠體微衛(wèi)星為候選位點(diǎn)，通過種（屬、科）間擴(kuò)增為杉木篩選適合的標(biāo)記位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣本材料

16個(gè)杉木優(yōu)樹單株（不同家系或無性系）用于檢測候選SSR位點(diǎn)、評估其多態(tài)性，其中12株（Y6, Y18, J5, J80, Ht14, Ht16, Jh10, Jh16, Y26,J18, Y110, Y1116）來源于湖南省攸縣杉木種子園（N27°18′, E113°47′），4 株（Lc6, Lc12, Lc18,Lc418）來源于廣東省樂昌市龍山杉木種子園（N25°12′, E113°28′）。不同杉木單株采嫩葉若干，干燥硅膠保存待用，DNA提取按改良CTAB法進(jìn)行[11]。

1.2 候選葉綠體SSR位點(diǎn)

21個(gè)候選葉綠體SSR位點(diǎn)中有8個(gè)（Pt1254、Pt63718、Pt102584、Pt9383、Pt15169、Pt110048、Pt36480、Pt107517） 選 自黑 松 Pinus thunbergii[12]、12個(gè)（CJCP1m_002、CJCP1m_003、CJCP1m_004、CJCP1m_007、CJCP2m_001、CJCP2m_002、CJCP2m_006、CJCP2m_007、CJCP2m_008、CJCP2m_009、CJCP2m_010、CJCP3）選自日本柳杉Cryptomeria japonica[13]、1個(gè)位點(diǎn)(cp56)的引物根據(jù)臺(tái)灣杉Cunninghamia konishii葉綠體非編碼區(qū)序列（Gi:30270556）自行設(shè)計(jì)。

1.3 PCR擴(kuò)增與多態(tài)性分析

首先利用2個(gè)樣本材料檢測候選SSR位點(diǎn)能否成功擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和條件按QIAGEN?多重PCR 試劑盒方法并做適當(dāng)調(diào)整。6.0 μL擴(kuò)增體系中含1× PCR混合液、0.2 μmol正向和反向引物、5～10 ng的DNA模板。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 15 min；94 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火90 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；60℃延伸30 min，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測候選位點(diǎn)是否有擴(kuò)增條帶。對于PCR成功擴(kuò)增的SSR位點(diǎn)，正向引物5' 端以FAM熒光標(biāo)記后用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增方法與前面相同。16個(gè)樣本的PCR片段基因分型在ABI3100自動(dòng)測序儀上進(jìn)行（Liz 600 為內(nèi)標(biāo)）。GeneScan收集基因分型結(jié)果，基因片段分析用Genotyper3.7軟件。HaplotypeAnalysis1.05軟件用于多態(tài)性位點(diǎn)單倍型分析，估算參數(shù)包括單倍型數(shù)量（A）、有效單倍型數(shù)量（Ne）、單倍型豐富度（Rh）和位點(diǎn)多樣性指數(shù)（H）等。

1.4 多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型測序與分析

多態(tài)性位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增結(jié)果直接用于測序分析。測序按BigDye?Terminator v3.1 試劑盒方法 (Applied Biosystems)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇純化后在ABI3100測序儀上雙向測序（F和R端）。序列經(jīng)Sequencher 4.10軟件剪切、拼接后用MEGA 5.05軟件比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體SSR擴(kuò)增結(jié)果

21個(gè)候選位點(diǎn)中有10個(gè)能夠成功擴(kuò)增，產(chǎn)生了清晰條帶，這10個(gè)位點(diǎn)的特征信息見表1。成功擴(kuò)增位點(diǎn)有7個(gè)來自日本柳杉，屬間擴(kuò)增成功率達(dá)到了58.3%；有2個(gè)來自黑松，科間擴(kuò)增成功率為25.0%。cp56位點(diǎn)來自臺(tái)灣杉葉綠體非編碼區(qū)序列，也得到了成功擴(kuò)增。根據(jù)已有研究結(jié)果，不同物種間擴(kuò)增成功率與其親緣關(guān)系密切相關(guān)，親緣越近，擴(kuò)增成功率越高[14-15]。杉木與柳杉是杉科不同屬物種，而與黑松屬不同科物種，來自日本柳杉的SSR位點(diǎn)成功率明顯高于黑松。

2.2 多態(tài)性位點(diǎn)特性

16個(gè)杉木樣本基因分型結(jié)果表明，擴(kuò)增成 功 的10個(gè) 位 點(diǎn) 中2個(gè)（CJCP1m_004和CJCP2m_002）具有多態(tài)性，均來自于日本柳杉。位點(diǎn)CJCP1m_004檢測到2個(gè)單倍型， 核苷酸長度分別為164 bp和165 bp，SSR重復(fù)單元為1 bp（見圖1），與來源物種日本柳杉相同。該位點(diǎn)有效單倍型數(shù)量（Ne）為1.28，多樣性指數(shù)為0.233。位點(diǎn)CJCP2m_002檢測到6個(gè)單倍型，核苷酸長度分別為353、354、355、356、357和359 bp（見圖2），其中既有2 bp重復(fù)單元，又出現(xiàn)1 bp重復(fù)單元類型，與來源物種日本柳杉的2 bp重復(fù)單元[(AT)8]并不相同。該位點(diǎn)有效單倍型數(shù)量（Ne）為3.2，多樣性指數(shù)為0.733。

2.3 多態(tài)性位點(diǎn)單倍型變異分析

單倍型測序結(jié)果表明，CjCP1m_004位點(diǎn)的SSR重復(fù)單元為（T）n，與來源物種日本柳杉相同。但CJCP2m_002位點(diǎn)不僅有(AT)n2核苷酸重復(fù)單元，而且還存在(T)n單核苷酸重復(fù)單元（見圖3），與來源物種（日本柳杉）并不相同。CJCP2m_002位點(diǎn)的單倍型測序分析進(jìn)一步驗(yàn)證了基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。正是由于該位點(diǎn)在杉木葉綠體基因組中存在復(fù)合SSR重復(fù)單元，其單倍型變異則更為豐富。

表1 杉木種間擴(kuò)增法成功擴(kuò)增的cp-SSR位點(diǎn)信息?Table 1 Characterization of successful amplification loci of cp-SSR of C. lanceolata

圖1 位點(diǎn)CJCP1m_004 基因分型檢測結(jié)果（2個(gè)單倍型，每個(gè)單倍型各2個(gè)樣本）Fig. 1 Genotyping of locus CJCP1m_004 (showed 2 haplotypes and 2 samples of each haplotype)

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)以基因文庫構(gòu)建法（包括SSR富集文庫）為主[16-17]，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率較低。微衛(wèi)星標(biāo)記還可以利用種間擴(kuò)增法[18]進(jìn)行篩選，該方法基于微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性，具有經(jīng)濟(jì)、高效、快速等特點(diǎn)，是微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的便捷方式。相對于核基因組而言，葉綠體基因組進(jìn)化速度慢，保守性更強(qiáng)，很多葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記不僅能在種間有效擴(kuò)增，而且屬間、甚至不同科物種間也可能具有通用性。裸子植物中，Vendramin 等[6,19]開發(fā)的松Pinus、冷杉Abies葉綠體SSR可在多個(gè)科屬物種間擴(kuò)增，已成為裸子植物葉綠體微衛(wèi)星通用標(biāo)記。本研究選用的黑松葉綠體SSR在杉木中擴(kuò)增成功率為25.0%，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)，但來自日本柳杉的SSR位點(diǎn)擴(kuò)增成功率達(dá)到了58.3%，其中2個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性。建議利用種間擴(kuò)增法篩選候選標(biāo)記時(shí)，應(yīng)充分考慮物種間的親緣關(guān)系，盡量從親緣關(guān)系較近的物種篩選標(biāo)記位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中還有8個(gè)位點(diǎn)未檢測到多態(tài)性，這可能與檢測樣本數(shù)量過少（16個(gè)）或樣本間親緣關(guān)系較近有關(guān)，相信隨著杉木樣本數(shù)量的增多或選用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)，這些位點(diǎn)中可能還會(huì)有多態(tài)性位點(diǎn)存在。

圖2 位點(diǎn)CJCP2m_002基因分型檢測結(jié)果（6個(gè)單倍型）Fig. 2 Genotyping of locus CJCP2m_002 (showed 6 haplotypes)

圖3 位點(diǎn)CJCP2m_002 的6個(gè)單倍型序列比對結(jié)果（SSR部分）Fig. 3 Sequencing alignment results of 6 haplotypes from locus CJCP2m_002 (SSR sequence)

雖然葉綠體基因組保守性強(qiáng)，但不同物種間SSR核心序列變異現(xiàn)象仍較為普遍。這種變異不僅有SSR重復(fù)長度的不同，而且重復(fù)單元（motif）本身也會(huì)存在變異[20]，從而引起擴(kuò)增片段的高度多態(tài)性。Vendramin 等[6]檢測發(fā)現(xiàn)有3個(gè)葉綠體SSR位點(diǎn)（Pt15169、Pt48210、Pt87268）在黑松和歐洲白皮松Pinus leucodermis之間存在重復(fù)單元變異，表現(xiàn)為在間隔一定數(shù)量核苷酸序列后，相同重復(fù)單元又會(huì)出現(xiàn)。我們在杉木序列分析中發(fā)現(xiàn)CJCP2m_002位點(diǎn)更為特別，該位點(diǎn)不僅存在SSR長度差異，而且同時(shí)存在單核苷酸和2核苷酸重復(fù)單元類型，其在杉木葉綠體基因組中呈現(xiàn)高度多態(tài)性，16個(gè)檢測樣本中發(fā)現(xiàn)6個(gè)單倍型，多樣性指數(shù)達(dá)到了0.733。而在日本柳杉葉綠體基因組中，CJCP2m_002位點(diǎn)是2核苷酸重復(fù)單元類型，僅檢測到2個(gè)單倍型[13]，多樣性指數(shù)為0.201，這種現(xiàn)象說明CJCP2m_002在杉木葉綠體基因組中屬于高突變位點(diǎn)。因此，筆者在利用種間擴(kuò)增法篩選目標(biāo)物種的SSR位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)仔細(xì)檢查目標(biāo)物種的擴(kuò)增片段大小，必要時(shí)可對目標(biāo)物種的單倍型（等位基因）進(jìn)行測序分析，以全面掌握SSR核心序列的變異情況。

杉木葉綠體微衛(wèi)星分析中，筆者利用ABI3100測序儀檢測擴(kuò)增位點(diǎn)的多態(tài)性和單倍型大小，毛細(xì)管電泳技術(shù)高效、靈敏，能準(zhǔn)確分辨1 bp差異的擴(kuò)增片段。葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記中單核苷酸重復(fù)類型較為普遍，單倍型之間可能僅是幾個(gè)堿基，甚至1個(gè)堿基的差異，傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨能力有限。因此，在條件允許的情況下，建議利用自動(dòng)測序儀進(jìn)行葉綠體微衛(wèi)星基因分型研究，以獲得更為準(zhǔn)確可靠的分析結(jié)果。

[1] 尤 勇,洪菊生. RAPD 標(biāo)記在杉木種源遺傳變異上的應(yīng)用 [J].林業(yè)科學(xué),1998,34(4):32-38

[2] 齊 明. 杉木遠(yuǎn)交親本群體遺傳多樣性研究 [J]. 植物研究,2008, 28(3):299-303.

[3] Chung J D, Lin T P, Tan Y C. et al. Genetic diversity and biogeography of Cunninghamia konishii (Cupressaceae), an island species in Taiwan: a comparison with Cunninghamia lanceolata, a mainland species in China[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution,2004, 33(3): 792-801.

[4] Wen YF, Ueno S, Han WJ. et al. Development and characterization of 28 polymorphic EST-SSR markers for Cunninghamia lanceolata (Taxodiaceae) based on transcriptome sequences [J]. Silvae Genetica, 2013, 62.

[5] 陳伯望,洪菊生,施行博. 杉木和禿杉群體的葉綠體微衛(wèi)星分析 [J]. 林業(yè)科學(xué),2000,36(3):46-51.

[6] Pleines T, Jakob SS, Blattner FR. Application of non-coding DNA regions in intraspecif i c analyses [J]. Plant Syst. Evol., 2009,282(3-4):281–294.

[7] Ribeiro M M, Mariette S, Vendramin G G, et al. Comparison of genetic diversity estimates within and among populations of maritime pine using chloroplast simple-sequence repeat and amplified fragment length polymorphism data [J]. Mol. Ecol.,2002,11(5): 869-77.

[8] 傅大立,劉夢培,傅建敏,等.華仁杏種級分類地位的SSR分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(3):60-64.

[9] 張 田,李作洲,劉亞令,等.獼猴桃屬植物的cpSSR遺傳多樣性及其同域分布物種的雜交漸滲與同塑[J]. 生物多樣性,2007, 15 (1): 1-22.

[10] 奇文清,楊慧君,薛勇彪,等.杉木葉綠體和線粒體遺傳的研究 [J]. 植物學(xué)報(bào),1999,41(7):695-699.

[11] Tsumura Y, Yoshumura K, Tomaru N, et al. Molecular phylogeny of conifers using RFLP analysis of PCR-amplified specific chloroplast genes [J]. Theoretical and Applied Geneticist, 2005,91(8) : 1222-1236.

[12] Vendramin G G, Lelli L , Rossi P, et al. A set of primers for the amplification of 20 chloroplast microsatellites in Pinaceae [J].Molecular Ecology, 1996 , 5: 595-598.

[13] Hirao T, Watanabe A, Miyamoto N, et al. Development and characterization of chloroplast microsatellite markers for Cryptomeria japonica D. Don [J]. Molecular Ecology Resources,2009, 9:122–124.

[14] Primmer C R, M?ller A P, Ellegren H. A wide-range survey of cross-species microsatellite amplif i cation in birds [J]. Molecular Ecology,1996,5(3):365-378.

[15] Guo W, Wang W, Zhou B, et al. Cross-species transferability of G. arboreum-derived EST-SSRs in the diploid species of Gossypium[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2006, 112(8):1573-1581.

[16] Zane L, Bargelloni L, Patarnello T. Strategies for microsatellite isolation: a review [J]. Molecular Ecology, 2002, 11(1): 1-16.

[17] Hamilton M B, Pincus E L, Di-Fiore A, et al. Universal linker and ligation procedures for construction of genomic DNA libraries enriched for microsatellites [J]. Bio. Techniques, 1999,27(3): 500-507.

[18] Peakall R, Gilmore S, Keys W, et al. Cross-species amplif i cation of soybean (Glycine max) simple sequence repeats (SSRs)within the genus and other legume genera: implications for the transferability of SSRs in plants[J]. Molecular Biology and Evolution, 1998, 15 (10): 1275-1287.

[19] Vendramin G G, Ziegenhagen B. Characterisation and inheritance of polymorphic plastid microsatellites in Abies [J]. Genome,1997, 40:857-864.

[20] Jakob S S, Ihlow A, Blattner F R. Combined ecological niche modelling and molecular phylogeography revealed the evolutionary history of Hordeum marinum (Poaceae)-niche differentiation, loss of genetic diversity, and speciation in Mediterranean Quaternary refugia[J]. Molec. Ecol., 2007, 16(8):1713-1727.