侯 麗 沈 波 鄭玉芬 鄭 靜 朱 敏

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，滑膜炎持久反復發(fā)作，繼而侵犯骨組織，造成關節(jié)軟骨、骨和關節(jié)囊的破壞，最終導致關節(jié)畸形和功能喪失。其病因和發(fā)病機制至今尚未完全清楚，目前已有研究表明遺傳、環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)在RA的發(fā)病中具有極為重要的作用，特別是免疫紊亂與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關。人類白細胞抗原－G(human leukocyte antigen G，HLA－G)是近年發(fā)現(xiàn)的自身免疫負調(diào)控的重要靶標，在免疫調(diào)節(jié)及免疫耐受的維系中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，HLA－G不僅可通過與多種免疫活性細胞上的抑制性受體結合直接發(fā)揮免疫抑制的作用，還可以通過各種途徑誘導產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)，間接發(fā)揮免疫抑制作用，其異常表達可導致自身免疫耐受缺失或炎癥紊亂［1，2］。而HLA－G在RA中的功能和作用機制研究還剛起步，因此，本研究通過ELISA法檢測RA患者血漿sHLA－G水平，流式細胞術檢測外周血CD3+HLAG+T細胞、Treg細胞含量，分析三者表達變化及其相關性及與RA臨床特征的關系，以探討它們在RA發(fā)病過程中的可能作用，從而進一步加深對RA發(fā)病機制的認識，為RA免疫干預策略提供新的靶向。

材料與方法

1．臨床資料:40例RA患者均系溫州醫(yī)科大學附屬浙江省臺州醫(yī)院2013年1～5月期間就診的患者，診斷均符合美國風濕病協(xié)會1987年修訂的RA分類診斷標準［3］，其中男性17例，女性23例，患者年齡37～80歲，平均年齡57．8±11．0歲。詳細收集患者的臨床資料，包括癥狀、體征及實驗室檢查結果等。40例健康對照者均來自浙江省臺州醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，其中男性15例，女性25例，年齡27～79歲，平均年齡51．8±10．9歲。RA患者組與健康對照組年齡及性別均無差異。該臨床資料獲取所遵循程序符合負責人體試驗委員會所制定的倫理學標準，并取得受試對象的知情同意。

2．DAS28評分:DAS28評分參照 Prevoo等［4］的計算方法，即:DAS28=0．56×壓痛關節(jié)數(shù)+0．28×腫脹關節(jié)數(shù) +0．7×ln(紅細胞沉降率，ESR)×1．08+0．16。DAS28以 28個關節(jié)計分:包括雙肩、雙肘、雙腕、雙手掌指關節(jié)、雙手近端指間關節(jié)、雙膝關節(jié)。DAS28＞5．1表示高疾病活動度，3．2＜DAS28＜5．1表示中疾病活動度，2．6＜DAS28＜3．2表示低疾病活動度，DAS28＜2．6表示疾病緩解。

3．標本采集:分別抽取兩組研究對象清晨空腹靜脈血2ml，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，流式細胞術檢測CD3+HLA－G+T細胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞含量后，將剩余全血離心后分離血漿放－20℃保存。

4．主要試劑和儀器:抗人CD4－異硫氰酸熒光素(FITC)抗體、CD25－別藻青蛋白(APC)抗體、CD3－FITC抗體以及FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)，抗人Foxp3－藻紅蛋白(PE)抗體及其同型對照抗體、Foxp3固定/破膜工作液(Foxp3 Staining Buffer Set)、抗人HLA－G－PE抗體及其同型對照抗體(美國eBioscience公司);HLA－G5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(捷克共和國BioVendor公司)。

5．ELISA方法檢測血漿sHLA－G表達水平:具體步驟嚴格按照試劑盒步驟進行。讀取血漿樣本的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣本濃度。

6．流式細胞術檢測CD3+HLA－G+T細胞:標本管加入10μl CD3－FITC抗體和5μl HLA－G－PE抗體，對照管加入10μl CD3－FITC抗體和5μl同型對照抗體IgG2a －PE后，加入EDTA抗凝血100μl，混勻后室溫避光孵育15min，加溶血素2ml，混勻室溫避光10min，1000r/min離心6min后棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入0．5mlPBS重懸細胞后立即上機檢測。

7．流式細胞術檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞:每管加入10μl CD4－FITC抗體和10μl CD25－APC抗體后加入EDTA抗凝血100μl，混勻后室溫避光孵育20min，加溶血素2ml，混勻，室溫避光10min，1000r/min離心6min后棄上清，PBS洗滌1次，加入1ml固定/透膜劑，震蕩混勻，4℃避光孵育50min，透膜劑清洗液洗滌1次，用100μl透膜劑清洗液重懸細胞后標本管加入10μl Foxp3－PE抗體，對照管加入10μl同型對照抗體IgG1－PE，震蕩混勻，4℃避光孵育50min，透膜劑清洗液洗滌2次，加入0．5mlPBS重懸細胞后立即上機檢測。

8．統(tǒng)計學方法:數(shù)據(jù)用SPSS 17．0版統(tǒng)計軟件進行處理，檢測結果用均數(shù)±標準差(±s)或中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(Q25～Q75)表示。計量資料組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)分布類型分別采用獨立樣本t檢驗、非參數(shù)Mann－Whitney U檢驗，不同指標間的相關性用Spearman分析。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．RA患者血漿sHLA－G的表達及其與疾病的相關性:RA組血漿sHLA－G水平與健康對照組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義［36．41(28．28～80.87)U/ml vs 50．44(38．52 ～ 59．62)U/ml，P ＜0.001，圖1］。將RA患者血漿sHLA－G水平與疾病活動度及RA各相關抗體進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)sHLA－G水平與DAS28評分呈顯著負相關(r=－0．514，P=0．0007，圖 2)，而與 RF、ESR、CRP、抗CCP抗體和ANA水平等均無明顯相關性(P＞0.05)。

圖1 RA組與健康對照組血漿sHLA－G水平的比較

2．RA患者外周血CD3+HLA－G+T細胞的表達分析:RA患者外周血CD3+HLA －G+T細胞百分比較健康對照組明顯降低［1．05%(0．44% ～2．15%)vs 2.39%(1．09% ～5．52%)，P ＜0．001，圖 3］，差異具有統(tǒng)計學意義。此外，RA患者外周血CD3+HLAG+T細胞百分比與患者DAS28評分顯著負相關(r=－0．395，P=0．011，圖 4)，但未發(fā)現(xiàn) RA 患者 CD3+HLA－G+T細胞百分比與RF、ESR、CRP、抗CCP抗體和ANA水平等存在明顯相關性(P＞0.05)。

圖2 RA患者血漿sHLA－G水平與DAS28評分的相關性分析

圖3 RA組與健康對照組外周血CD3+HLA－G+T細胞百分比的比較

圖4 RA患者外周血CD3+HLA－G+T細胞百分比與DAS28評分的相關性分析

3．RA患者外周血Treg細胞的表達及其與HLA－G水平的相關性:實驗結果表明，RA患者外周血Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞)百分比較健康對照組明顯降低［3．25%(2．31% ～4．75%)vs 4．47%(3．66% ～6．30%)，P ＜0．01，圖 5］。另外，對RA患者外周血Treg細胞百分比與sHLA－G水平和CD3+HLA－G+T細胞百分比進行相關性分析，結果顯示，Treg細胞百分比與sHLA－G水平存在明顯相關性(r=0．407，P=0．009，圖 6)，而 Treg 細胞百分比與CD3+HLA－G+T細胞百分比無明顯相關性(r=0.203，P=0．208)。

圖5 RA組與健康對照組外周血Treg細胞百分比的比較

圖6 RA患者sHLA－G水平與Treg細胞百分比的相關性分析

討 論

近年研究表明HLA－G分子在母胎免疫、器官移植、腫瘤以及慢性炎癥性疾病的免疫耐受中發(fā)揮重要作用［5～7］。HLA－G是機體內(nèi)一個重要的免疫調(diào)節(jié)分子，具有mHLA－G(HLA－G1－G4)和sHLAG(HLA－G5－G7)兩種表達方式。mHLA－G與sHLA－G分子在功能上有著相似的抑制機體免疫活性細胞的生物學作用，它們主要通過與表達靶細胞表面的特異性受體 ILT2、ILT4、KIR2DL4 等結合［8］，傳遞抑制信號，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能，如抑制CD4+T細胞的增殖和干擾原始CD4+T細胞對Th1/Th2、Th17/Treg細胞的分化。誘導活化的CD8+T細胞和CD8+NK細胞發(fā)生凋亡，抑制細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞的細胞殺傷活性，抑制樹突狀細胞(DC)等的抗原遞呈作用等［1］。此外，HLA－G還可通過各種途徑誘導產(chǎn)生Treg細胞，進而發(fā)揮免疫抑制作用。Selmani等［2］體外研究發(fā)現(xiàn)，由人骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的HLA－G5可誘導T細胞分化成CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞。另外，經(jīng)HLA－G誘導的致耐受DC細胞又能誘導T細胞分化成CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞。而Treg細胞可通過細胞間直接接觸和分泌抑制性細胞因子(如IL－10、TGF－β)等途徑發(fā)揮其免疫抑制的功能。因此，HLA－G的表達及其誘導產(chǎn)生Treg細胞的潛在作用對維持機體免疫自穩(wěn)，防止自身免疫性疾病具有極其重要的作用。故我們探討其在RA中的臨床應用價值。

事實上，已有研究報道，RA患者血清sHLA－G濃度顯著低于對照組，但血清sHLA－G濃度與RA炎癥活度度指標呈正相關［9］。而 Rizzo等［10］對早期RA患者進行研究，發(fā)現(xiàn)早期RA患者血漿sHLA－G水平亦對照組顯著降低，且血漿sHLA－G水平與RA的炎癥活動度指標負相關。這些都表明sHLA－G的異常表達可能與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關。在本研究中，筆者通過ELISA法檢測，發(fā)現(xiàn)RA患者血漿sHLA－G水平比健康對照組明顯降低。同時，通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)RA患者外周血CD3+HLAG+T細胞百分比也較對照組明顯降低，說明RA患者外周血中可能不僅存在sHLA－G的表達降低，還存在mHLA－G的表達降低，而且可能正是因為這些分子表達數(shù)量上的缺失，導致了機體免疫抑制功能的低下，從而使T細胞、NK細胞、DC細胞等各種免疫細胞異?；罨毎麃喨浩胶馐Э?，給RA的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造了條件。

另外，筆者還對RA患者sHLA－G水平及CD3+HLA－G+T細胞含量與RA疾病活動度DAS28評分及各臨床指標進行了相關性分析。結果顯示，RA患者sHLA－G水平和CD3+HLA－G+T細胞百分比均與患者DAS28評分呈顯著負相關，提示疾病活動度越高的患者，可能HLA－G分子表達降低越明顯，從而導致患者病情越嚴重。另外，HLA－G具有抗炎和免疫抑制的功能，因此這些分子的存在可能會影響疾病的活動性。但是，未發(fā)現(xiàn)RA患者sHLA－G水平及CD3+HLA－G+T細胞百分比與 RF、ESR、CRP、抗CCP抗體和ANA水平等存在明顯相關性，可能與樣本數(shù)量不夠等因素有關，具體的關系還有待于進一步深入研究。

越來越多的研究表明，RA患者體內(nèi)存在Treg細胞數(shù)量減少和(或)功能降低，提示Treg細胞的異常與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關［11］。近年，HLA－G表達與Treg細胞之間的關系受到人們的廣泛關注，二者之間的相關性已在腫瘤［6］、器官移植等多種疾病中得到證實，但關于HLA－G與Treg細胞在自身免疫性疾病中的相互關系尚無研究報道。筆者的研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血Treg細胞百分比較對照組明顯降低，與之前研究結果一致。同時，為了更好的分析RA患者外周血Treg細胞水平與HLA－G表達之間相關性，筆者分別對RA患者Treg細胞百分比與sHLAG水平和CD3+HLA－G+T細胞百分比進行相關性分析，結果顯示，Treg細胞百分比與sHLA－G水平存在明顯正相關性，而與CD3+HLA－G+T細胞百分比可能存在正相關，但結果顯示差異無統(tǒng)計學意義，表明HLA－G與Treg細胞在RA免疫負調(diào)節(jié)的作用中具有明顯相關性。由此，筆者推測HLA－G和Treg細胞之間可能存在相互誘導和調(diào)節(jié)的信號途徑，并對誘導和維持機體自身免疫耐受起著重要的協(xié)同作用，而這種協(xié)同作用可能主要表現(xiàn)在sHLA－G與Treg細胞之間，其中關于其內(nèi)在的具體機制和調(diào)節(jié)因素還有待于進一步深入研究。

綜上所述，筆者的研究結果表明，RA患者血漿sHLA－G水平及外周血T細胞表達mHLA－G異常降低，提示RA患者體內(nèi)免疫抑制功能低下，從而導致各種炎癥細胞逃避死亡，細胞異?；罨图毎麃喨旱钠胶馐Э氐龋瑯O大促進RA的發(fā)生發(fā)展。目前國內(nèi)外尚無HLA－G與Treg細胞在RA中的相關性研究，而筆者的研究發(fā)現(xiàn)RA患者sHLA－G水平與Treg細胞百分比呈顯著正相關，由此推測HLA－G分子和Treg細胞之間可能存在相互誘導和調(diào)節(jié)的信號途徑，并對誘導和維持機體自身免疫耐受起著重要的協(xié)同作用，因此，進一步深入研究和闡明其相關信號通路及具體機制有助于理解RA的發(fā)病機制及為RA免疫干預策略提供新的靶向。

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