徐 蕾，袁 方，李若谷，王 倩，鄭洪珍，楊奕清

(上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心內(nèi)科，上海200030)

先天性二葉式主動(dòng)脈瓣畸形(bicuspid aortic valve，BAV)是人類最常見(jiàn)的先天性心臟病，其在一般人群中的發(fā)病率約為0.5% ～2.0%，男性發(fā)病率較女性高，男女之比約為3∶1[1]。BAV 患者容易出現(xiàn)許多嚴(yán)重并發(fā)癥，如主動(dòng)脈瓣反流、主動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)脈擴(kuò)張甚至主動(dòng)脈瘤、主動(dòng)脈夾層、血栓形成和感染性心內(nèi)膜炎等[2-3]，明顯增加了患者的病殘率和病死率。遺傳流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)BAV具有顯著的家族聚集性，BAV患者一級(jí)親屬的患病率在9% ～24%，遺傳度可高達(dá)89%，提示遺傳缺陷是BAV的重要病因[4]。通過(guò)連鎖分析和候選基因分析，目前已經(jīng)定位了至少4個(gè)BAV基因座并發(fā)現(xiàn)了多個(gè) BAV相關(guān)基因，如NOTCH1和KCNJ2[5-6]。然而大部分BAV患者的致病基因仍有待于識(shí)別。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，心臟轉(zhuǎn)錄因子基因GATA5在心血管發(fā)育方面起著重要作用[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，小鼠敲除GATA5基因可導(dǎo)致BAV[8]。在人類，GATA5基因突變可導(dǎo)致心臟間隔缺損、法洛四聯(lián)癥、右室雙流出道和BAV等心血管結(jié)構(gòu)缺陷以及心房顫動(dòng)等[9-14]。然而，BAV相關(guān)GATA5基因突變譜仍有待進(jìn)一步研究。

材料和方法

一、對(duì)象

選取2011年1月至2013年6月上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院就診、無(wú)血緣關(guān)系的先天性BAV患者150例，其中男81例，女69例，年齡32～65歲;另同期選取200名無(wú)血緣關(guān)系的健康對(duì)照者作為正常對(duì)照組，其中男106名，女94名，年齡30～62歲。所有對(duì)象均為中國(guó)漢族人，均知情同意。臨床評(píng)估包括詳細(xì)病史、全面體檢以及心臟超聲和心電圖檢查。

二、方法

1.標(biāo)本采集 所有對(duì)象均采集外周靜脈血3 mL，置于含有0.5 mL抗凝劑(枸櫞酸、枸櫞酸鈉、葡萄糖混合液)的試管中，混勻后-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.基因組DNA的抽提 使用基因組DNA(genomic DNA，gDNA)抽提試劑盒(美國(guó)Promega公司)，按照操作說(shuō)明書自全部研究對(duì)象的外周靜脈血標(biāo)本抽提gDNA。

3.擴(kuò)增GATA5基因編碼區(qū)和剪接點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中GATA5基因的 gDNA序列(登陸號(hào):NT_011362)，利用Primer 3.0軟件計(jì)算機(jī)輔助在線設(shè)計(jì)6對(duì)引物以擴(kuò)增GATA5基因的6個(gè)編碼外顯子(外顯子2～7)及其2側(cè)的部分內(nèi)含子。引物序列見(jiàn)表1[13]，引物均由上海生工生物工程公司合成。

表1 擴(kuò)增GATA5基因編碼外顯子和剪接點(diǎn)的引物序列

4.GATA5基因目的片段的擴(kuò)增 以研究對(duì)象的gDNA為模板，采用HotStar Taq DNA聚合酶等聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑(德國(guó)Qiagen公司)，分別使用上述6對(duì)引物在ABI PE9700熱循環(huán)儀(美國(guó)ABI公司)上通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因片段。使用QIAquick凝膠回收試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

5.GATA5基因目的DNA片段的測(cè)序 使用Big Dye Terminator v3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒(美國(guó)ABI公司)在ABI PRISM 3130 XL型DNA分析儀(美國(guó)ABI公司)上對(duì)每一純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序引物同上述用于特定區(qū)域擴(kuò)增的引物。使用5.1版本DNA測(cè)序分析軟件(美國(guó)ABI公司)分析測(cè)序結(jié)果并將所測(cè)序列與GenBank中的已知GATA5序列(登陸號(hào):NM_080473)進(jìn)行比對(duì)以識(shí)別基因變異。對(duì)于所識(shí)別的基因變異，檢索PubMed和SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)以及萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.wanfangdata.com.cn)以明確是否已有報(bào)道。

6.多物種GATA5蛋白序列比對(duì)分析 采用在線分析程序 MUSCLE V3.6(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對(duì)比分析多物種 GATA5蛋白氨基酸序列。

7.GATA5突變的致病性預(yù)測(cè) 使用在線程序MutationTaster(http://www.mutationtaster.org)預(yù)測(cè)所識(shí)別的GATA5突變的致病性，并給出正確預(yù)測(cè)的概率值(該值越接近1表示預(yù)測(cè)的正確性越高)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、GATA5基因突變分析

臨床評(píng)估發(fā)現(xiàn)BAV組均無(wú)明顯的BAV傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，如母親孕期服用藥物、病毒感染以及接觸毒物或放射線照射等。通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)150例BAV患者中有2例患者發(fā)現(xiàn)了2種GATA5雜合錯(cuò)義突變，突變率約為1.33%;在正常對(duì)照組中均未發(fā)現(xiàn)這2種GATA5基因突變。經(jīng)檢索PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)、SNP數(shù)據(jù)庫(kù)以及萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)，這2種GATA5基因突變均無(wú)報(bào)道，提示為新突變。

具體而言，在1例57歲男性散發(fā)性BAV患者中，其GATA5基因編碼核苷酸序列第657位的鳥嘌呤(guanine，G)變?yōu)榘奏?cytosine，C)，即c.657G＞C突變，導(dǎo)致GATA5基因編碼氨基酸序列第219位的蛋氨酸(methionine，M)變?yōu)楫惲涟彼?isoleucine，I)，即 p.M219I突變。GATA5 基因c.657G＞C突變及其對(duì)照序列見(jiàn)圖1。

注:箭頭所指分別為GATA5基因野生型純合子G/G和突變型雜合子G/C序列

在另1例46歲女性散發(fā)性BAV患者中，其GATA5基因編碼核苷酸序列第866位的C變?yōu)樾叵汆奏?thymine，T)，即 c.866C ＞T突變，導(dǎo)致GATA5基因編碼氨基酸序列第289位的蘇氨酸(threonine，T)變?yōu)?I，即 p.T289I突變。GATA5 基因c.866C＞T突變及其對(duì)照序列見(jiàn)圖2。

GATA5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與顯示BAV相關(guān)基因突變的示意圖見(jiàn)圖3。

二、被改變氨基酸保守性分析

多物種GATA5蛋白序列比對(duì)顯示被改變氨基酸在進(jìn)化上均完全保守，提示這些氨基酸在GATA5功能上十分重要。見(jiàn)圖4。

圖2 GATA5基因c.866C＞T突變及其對(duì)照序列

圖3 標(biāo)示BAV相關(guān)突變位點(diǎn)的GATA5蛋白質(zhì)結(jié)示意圖

圖4 多物種GATA5蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

三、所識(shí)別的GATA5基因突變的致病性分析

經(jīng)MutationTaster預(yù)測(cè)，所識(shí)別的GATA5基因變異c.657G＞C和c.866C＞T均為致病性突變，預(yù)測(cè)正確的概率值分別為0.999 999 991 295 232和0.999 999 996 908 734。在 MutationTaster數(shù)據(jù)庫(kù)中，沒(méi)有報(bào)道本研究所發(fā)現(xiàn)的GATA5基因變異，進(jìn)一步表明這些GATA5基因變異是新突變。

討 論

本研究在2例無(wú)血緣關(guān)系的家族史陰性的BAV患者發(fā)現(xiàn)了2種新的GATA5基因突變p.M219I和 p.T289I，這些突變不存在于 200 名無(wú)血緣關(guān)系的健康對(duì)照者中。多物種GATA5蛋白序列比對(duì)顯示被改變的氨基酸在進(jìn)化上完全保守，計(jì)算機(jī)功能模擬分析提示這些突變具有致病性。因此，GATA5基因突變很可能是這2例BAV患者發(fā)病的分子病因，但確切的致病機(jī)制和致病性的大小仍有待于研究。

人類GATA5基因定位于20q13.33，編碼一種由397個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子，在心臟發(fā)育期間調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因的表達(dá)，包括心房利鈉肽、α-肌凝蛋白重鏈、β-肌凝蛋白重鏈、心肌肌鈣蛋白C和心肌肌鈣蛋白 I[15-16]。因此，GATA5基因突變很可能通過(guò)影響這些對(duì)心血管正常發(fā)育至關(guān)重要的靶基因的表達(dá)而促發(fā)心血管畸形。

GATA5基因缺陷對(duì)心血管畸形的誘導(dǎo)作用已經(jīng)被一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)。在斑馬魚中，GATA5基因敲除可因心內(nèi)膜和心肌分化遷移障礙而導(dǎo)致胚胎死亡[17]。在小鼠中，GATA5基因敲除或心內(nèi)膜細(xì)胞特異性失活GATA5均可導(dǎo)致BAV，外顯率可達(dá) 25%[8]。另外，GATA5和 GATA4或 GATA5和GATA6雙基因敲除雜合子小鼠在胚胎期或出生后不久即死亡，主要是由于心臟流出道發(fā)育嚴(yán)重缺陷如右室雙流出道、室間隔缺損等[18]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GATA5基因?qū)π难芟到y(tǒng)的正常發(fā)育具有關(guān)鍵調(diào)控作用。

GATA5基因變異與人類BAV的關(guān)系以前也有報(bào)道。Padang等[12]對(duì)100例無(wú)血緣關(guān)系的BAV患者的GATA5基因的編碼外顯子和其兩側(cè)的部分內(nèi)含子進(jìn)行了測(cè)序分析，結(jié)果在4例患者發(fā)現(xiàn)了4種 GATA5基因錯(cuò)義突變，即 p.Q3R、p.S19W、p.Y142H 和 p.G166S，突變率為 4%。這些新發(fā)現(xiàn)的GATA5基因突變的致病作用大小及其機(jī)制也有待研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了BAV相關(guān)GATA5基因新突變，揭示了BAV新的分子病因，這不僅有助于揭示BAV新的分子機(jī)制，也有助于BAV患者的危險(xiǎn)分層、早期預(yù)防和個(gè)體化治療。

[1]Go AS，Mozaffarian D，Roger VL，et al.Heart disease and stroke statistics-2013 update:a report from the American Heart Association[J].Circulation，2013，127(1):e6-e245.

[2]Siu SC，Silversides CK.Bicuspid aortic valve disease[J].J Am Coll Cardiol，2010，55(25):2789-2800.

[3]Alegret JM，Ligero C，Vernis JM，et al.Factors related to the need for surgery after the diagnosis of bicuspid aortic valve:one center's experience under a conservative approach[J].Int J Med Sci，2013，10(2):176-182.

[4]Cripe L，Andelfinger G，Martin LJ，et al.Bicuspid aortic valve is heritable[J].J Am Coll Cardiol，2004，44(1):138-143.

[5]Garg V，Muth AN，Ransom JF，et al.Mutations in NOTCH1 cause aortic valve disease[J].Nature，2005，437(7056):270-274.

[6]Andelfinger G，Tapper AR，Welch RC，et al.KCNJ2 mutation results in Andersen syndrome with sexspecific cardiac and skeletal muscle phenotypes[J].Am J Hum Genet，2002，71(3):663-668.

[7]Peterkin T，Gibson A，Loose M，et al.The roles of GATA-4，-5 and-6 in vertebrate heart development[J].Semin Cell Dev Biol，2005，16(1):83-94.

[8]Laforest B，Andelfinger G，Nemer M.Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve[J].J Clin Invest，2011，121(7):2876-2887.

[9]Jiang JQ，Li RG，Wang J，et al.Prevalence and spectrum of GATA5 mutations associated with congenital heart disease[J].Int J Cardiol，2013，165(3):570-573.

[10]Wei D，Bao H，Zhou N，et al.GATA5 loss-of-function mutation responsible for the congenital ventriculoseptal defect[J].Pediatr Cardiol，2013，34(3):504-511.

[11]Wei D，Bao H，Liu XY，et al.GATA5 loss-of-function mutations underlie tetralogy of fallot[J].Int J Med Sci，2013，10(1):34-42.

[12]Padang R，Bagnall RD，Richmond DR，et al.Rare non-synonymous variations in the transcriptional activation domains of GATA5 in bicuspid aortic valve disease[J].J Mol Cell Cardiol，2012，53(2):277-281.

[13]Yang YQ，Wang J，Wang XH，et al.Mutational spectrum of the GATA5 gene associated with familial atrial fibrillation[J].Int J Cardiol，2012，157(2):305-307.

[14]Wang XH，Huang CX，Wang Q，et al.A novel GATA5 loss-of-function mutation underlies lone atrial fibrillation[J].Int J Mol Med，2013，31(1):43-50.

[15]Nemer G，Qureshi ST，Malo D，et al.Functional analysis and chromosomal mapping of Gata5，a gene encoding a zinc finger DNA-binding protein[J].Mamm Genome，1999，10(10):993-999.

[16]Pikkarainen S，Tokola H，Kerkel? R，et al.GATA transcription factors in the developing and adult heart[J].Cardiovasc Res，2004，63(2):196-207.

[17]Heicklen-Klein A，McReynolds LJ，Evans T.Using the zebrafish model to study GATA transcription factors[J].Semin Cell Dev Biol，2005，16(1):95-106.

[18]Laforest B，Nemer M.GATA5 interacts with GATA4 and GATA6 in outflow tract development[J].Dev Biol，2011，358(2):368-378.