呂曉楠，葉輝銘，2，顧 龍，曾驥孟

(1.廈門(mén)大學(xué)藥學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，福建廈門(mén)361005;2.廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨檢中心，福建廈門(mén)361004)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是第一個(gè)將染色體異常與特定的腫瘤類型聯(lián)系在一起的惡性血液性疾病，占成人白血病的15%，在我國(guó)年發(fā)病率為0.36/10萬(wàn)人[1]。超過(guò)95%以上的CML患者由于染色質(zhì)異常產(chǎn)生基因融合(如BCR-ABL)，染色體顯帶分析為t(9;22)(q34;q11)，即費(fèi)城染色體(philadelphia chromosome，Ph)[2]。融合基因編碼一種酪氨酸激酶，誘導(dǎo)多種致癌性的信號(hào)通路，這是CML發(fā)病的主要分子機(jī)制之一。因BCR和ABL基因斷裂點(diǎn)不同，產(chǎn)生多種多樣的融合形式，臨床上最常見(jiàn)的是e1a2、e13a2 和 e14a2[2]。CML 的治療方案也多是針對(duì)Ph陽(yáng)性細(xì)胞系或BCR-ABL蛋白本身進(jìn)行的，例如利用靶向藥物伊馬替尼(Imatinib)來(lái)抑制BCA-ABL通路[3]。因此BCR-ABL融合基因的檢測(cè)對(duì)于CML的分型診斷、分子機(jī)制研究以及治療方案選擇、預(yù)后判斷等都有著重要意義。

目前融合基因的檢測(cè)方法主要有染色體核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)以及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription PCR，RT-PCR)等。染色體核型分析雖是臨床上常規(guī)檢測(cè)手段，但對(duì)樣本和技術(shù)要求高，檢測(cè)靈敏度低，尤其對(duì)于微小染色體易位難以檢測(cè)出，故臨床上通常還需要分子生物學(xué)等手段來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證[4]。FISH雖可清晰的辨認(rèn)各染色體結(jié)構(gòu)異常，但價(jià)格昂貴，操作繁瑣，假陽(yáng)性率較高(＞10%)，且當(dāng)Ph陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%時(shí)即不適用[5]。相對(duì)于前兩者，PCR擴(kuò)增法對(duì)于樣本要求不高，且具有檢測(cè)快速，敏感度高等優(yōu)點(diǎn)。因此，我們擬采用RT-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳技術(shù)一次性檢測(cè)BCR-ABL融合基因多種融合形式(如e1a2、e13a2、e14a2)，以期建立一種快速、簡(jiǎn)單、有效的檢測(cè)方法，用以CML輔助診斷、分型、預(yù)后判斷以及療效評(píng)價(jià)等。

材料和方法

一、對(duì)象

血液樣本均來(lái)源于廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院，其中融合基因陽(yáng)性模板構(gòu)建樣本來(lái)自體檢中心健康體檢者，研究病例來(lái)自血液科2010年至2013年住院的CML患者50例，男34例，女16例，年齡15～85歲，全部病例經(jīng)過(guò)臨床血象、骨髓象等形態(tài)學(xué)檢測(cè)初步確診，且均進(jìn)行了染色體核型分析，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表1[6-8]。正常對(duì)照組為18名健康體檢者，男10名，女8名，年齡18～70歲。

表1 CML的診斷標(biāo)準(zhǔn)

二、方法

1.血液樣本RNA提取和cDNA模板第一鏈合成 CML患者及體檢者外周抗凝全血5mL，采集后盡快進(jìn)行RNA抽提，以防時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或反復(fù)凍融后損壞RNA的品質(zhì)。設(shè)備為MagCoreHF16全自動(dòng)核酸抽提儀及其配套全血RNA抽提試劑盒(廈門(mén)芮寶生醫(yī)股份公司)，操作嚴(yán)格按儀器和試劑盒說(shuō)明書(shū);并用TransScript cDNA第一鏈合成試劑盒(北京全式金公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，將cDNA模板分裝，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.BCR-ABL融合基因陽(yáng)性模板構(gòu)建 采用重疊延伸PCR法[9]構(gòu)建BCR-ABL的3種融合形式，作為陽(yáng)性對(duì)照品。遵循其原理步驟，我們以正常血液cDNA(無(wú)BCR-ABL融合基因)為模板，采用TransGen高保真酶熱啟動(dòng)酶FastPfu(北京全式金公司)，首先分別擴(kuò)增ABL和BCR基因，產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳、對(duì)目的片段切膠、用膠回收試劑盒(上海生工)回收，再以2種回收的產(chǎn)物為模板(保持使用量均等)，在同1個(gè)PCR反應(yīng)體系里進(jìn)行融合擴(kuò)增。每個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物設(shè)置2個(gè)平行，1個(gè)陰性對(duì)照，陰性對(duì)照里不加模板，以檢測(cè)PCR體系中的試劑是否被污染。將回收的PCR產(chǎn)物連接到 TransGen pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

3.引物設(shè)計(jì) BCR基因以其在NCBI中的登錄號(hào)NM_004327上的mRNA序列為準(zhǔn)，ABL基因則以文獻(xiàn)中常見(jiàn)的登錄號(hào)X16416上的mRNA序列為準(zhǔn)。擴(kuò)增所需引物(表2、表3)的設(shè)計(jì)均通過(guò)軟件 Primer Premier v 5.00進(jìn)行，并經(jīng) BLAST比對(duì)確認(rèn)其特異性。設(shè)計(jì)好的引物由上海生工合成，回來(lái)后進(jìn)行稀釋，分裝成多管保存在－20℃，避免反復(fù)凍融。

表2 構(gòu)建陽(yáng)性模板的引物設(shè)計(jì)

表3 檢測(cè)融合基因的多重引物設(shè)計(jì)

4.多重RT-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)體系的建立與優(yōu)化 初始反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液2.5μL，2.5 mmol Mg2+2μL，2.5 mmol dNTPs 2μL，10 μmol/L 上、下游引物各 0.5μL，5 U/μL TaqDNA 聚合酶 0.4μL，cDNA 模板 5μL，加雙蒸水，補(bǔ)足反應(yīng)總體積為25μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 1 min;95℃ 30 s，66～61℃ 30 s(每個(gè)循環(huán)降低1℃)，72 ℃ 20 s，5 個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s，61 ℃30 s，72℃ 20 s，25個(gè)循環(huán)。影響多重RT-PCR反應(yīng)的因素很多[10]，如退火溫度、酶用量、引物對(duì)的濃度等。本研究采用了退火溫度Touchdown的PCR反應(yīng)程序[11]，故在此不再進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，主要對(duì)后兩種影響因素進(jìn)行了條件實(shí)驗(yàn)，在其它參數(shù)不變的情況下，依次改變1個(gè)參數(shù):(1)優(yōu)化酶用量:從1.0 ～2.5 U，每梯度相差 0.5U;(2)引物濃度:從 0.08 ～ 0.2 μmol/L，每濃度梯度相差0.04 μmol/L。通過(guò)考察是否有引物二聚體產(chǎn)生、存在特異引物等選擇最佳反應(yīng)體系。檢測(cè)體系采用了毛細(xì)管電泳檢測(cè)(BIOptic's Qsep100 DNA-CE，臺(tái)灣)[12]，使用的是熔融態(tài)成型的二氧化硅毛細(xì)管柱，內(nèi)徑75μL，柱長(zhǎng)150 mm，緩沖液為 Mops-Tris(pH 值 7.55)。上樣體積0.5μL，25℃下4 kV 15 s電動(dòng)進(jìn)樣，8 kV恒壓電泳，在590 nm處檢測(cè)激光誘導(dǎo)的溴化乙錠的發(fā)射波長(zhǎng)。

5.多重RT-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)體系的性能評(píng)估 (1)靈敏度分析:將構(gòu)建的陽(yáng)性模板(e1a2、e13a2和e14a2)質(zhì)粒均進(jìn)行10倍梯度稀釋，即稀釋成100～107拷貝/μL 8個(gè)濃度梯度，在優(yōu)化的PCR條件下進(jìn)行反應(yīng)，分析該方法最低檢測(cè)拷貝。每個(gè)濃度梯度作2個(gè)平行反應(yīng)，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置1個(gè)陰性對(duì)照(以滅菌超純水為模板);(2)特異性分析:檢測(cè)18名健康體檢者外周血融合基因，觀察此方法的特異性;(3)模擬分析:將構(gòu)建成功的 BCR-ABL融合模板(e1a2、e13a2、e14a2，105 拷貝/μL)分別與正常人血液cDNA(50 ng/μL)進(jìn)行混合，模擬自建方法檢測(cè)臨床陽(yáng)性樣本的情況。

6.多重RT-PCR體系檢測(cè)臨床樣本的BCRABL融合基因 用自建的多重RT-PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)平行檢測(cè)50例CML患者患者。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用McNemar檢驗(yàn)和一致性檢驗(yàn)分析，評(píng)價(jià)建立的多重RT-PCR法的陽(yáng)性率以及與熒光定量PCR法結(jié)果總符合率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、成功構(gòu)建BCR-ABL融合基因陽(yáng)性模板

通過(guò)重疊延伸法，第1次PCR分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物BCR-1/2/3(468/142/217 bp)和ABL-1/2/3(291/295/297 bp)，第2次融合擴(kuò)增PCR反應(yīng)得到 BCR-ABL基因的 3種融合形式，即 e1a2(724bp)，e13a2(398bp)，e14a2(473bp)。2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。以超純水作為陰性對(duì)照。

圖1 融合形式e1a2模板構(gòu)建電泳圖

圖2 融合形式e13a2和e14a2模板構(gòu)建電泳圖

二、多重RT-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)體系的建立與優(yōu)化

分別設(shè)置的1.0～2.5 U的酶用量梯度以及0.08 ～ 0.2 μmol/L 的引物濃度梯度結(jié)果顯示BCR-ABL融合基因PCR體系中最佳酶和引物用量分別為 0.2μL 和 0.3μL。因此，建立的多重RT-PCR最佳反應(yīng)體系為:10 PCR緩沖液2.5μL，2.5 mmol Mg2+2μL，2.5 mmol dNTPs 2μL，10 μmol/L 上下游共 3 條引物各 0.3μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.2μL，構(gòu)建的陽(yáng)性模板 cDNA 5μL，加雙蒸水，補(bǔ)足反應(yīng)總體積為 25μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行毛細(xì)管電泳結(jié)果與2%瓊脂糖電泳，電泳結(jié)果一致，但毛細(xì)管電泳能夠準(zhǔn)確的計(jì)算出產(chǎn)物長(zhǎng)度，進(jìn)樣量少，操作自動(dòng)化，方便臨床大批量樣本快速、準(zhǔn)確、直觀的檢測(cè)。

三、檢測(cè)性能評(píng)價(jià)

1.靈敏度分析 將 e1a2、e13a2和 e14a2 3種模板以10倍梯度稀釋，系列稀釋樣本檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。e1a2本法的最低檢測(cè)限為102拷貝/μL，e13a2和e14a2均為103拷貝/μL。

2.特異性分析 18名健康體檢者外周血標(biāo)本中均未檢測(cè)到BCR-ABL融合基因，表明本法具有良好的特異性。

3.模擬分析 陽(yáng)性模板與正常人血液混合后的模擬樣本檢測(cè)結(jié)果如圖4，3～6號(hào)混合標(biāo)本電泳出現(xiàn)的條帶與預(yù)期一致，正常血液無(wú)陽(yáng)性電泳結(jié)果。

圖3 靈敏度分析電泳結(jié)果

圖4 模擬血液環(huán)境中檢測(cè)到的e1a2、e13a2、e14a2毛細(xì)管電泳圖

四、臨床樣本檢測(cè)

應(yīng)用自建的多重RT-PCR聯(lián)合毛細(xì)管電泳方法對(duì)50例CML的患者外周血進(jìn)行融合基因檢測(cè)，BCR-ABL融合基因陽(yáng)性率為86.0%(43/50)，其中e13a2型20.0%、e14a2型66.0%，陽(yáng)性率較低與本組病例中包括6例復(fù)診者有關(guān)。與骨髓細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析比較，本方法檢測(cè)BCRABL融合基因的陽(yáng)性符合率為97.6%(41/42)，陰性符合率為75.0%(6/8)，總符合率為94.0%(47/50)，2種方法具有較高的一致性(Kappa=0.765，P ＞0.05)(表 4)。

以1例CML患者為例，其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5?；颊叩碾娪窘Y(jié)果與e14a2陽(yáng)性對(duì)照模板處于一個(gè)位置，即表示此CML患者存在BCR-ABL融合基因的e14a2融合形式。檢測(cè)中以正常血液為陰性對(duì)照，確保此方法特異性;以構(gòu)建的陽(yáng)性模板為陽(yáng)性對(duì)照;以超純水做模板為空白對(duì)照，以排除試劑污染。

表4 2種方法檢測(cè)BCR-ABL融合基因結(jié)果比較

圖5 檢測(cè)患者樣本融合基因的色譜圖

討 論

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行白血病診斷分型需要聯(lián)合通過(guò)形態(tài)學(xué)(morphology，M)、免疫學(xué)(immunology，I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(cytogenetics，C)和分子生物學(xué)(molecular biology，M)檢查，即MICM 分型系統(tǒng)。就CML而言，由于超過(guò)95%患者具有費(fèi)城染色體，故細(xì)胞遺傳學(xué)方法如核型分析即為初始判斷CML的常規(guī)手段。然而，這個(gè)方法樣本要求高，靈敏度低(一般在5%以上)，無(wú)法檢測(cè)到細(xì)微的染色體易位(約占所有患者的5%)[13]，故臨床上還需要輔助手段來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

早期檢測(cè)融合基因的PCR法常將多重PCR與巢式PCR結(jié)合，該類方法靈敏度(10－4～10－5)高，在微小殘留性疾病的監(jiān)測(cè)上具有重要意義[4，14]，但是由于進(jìn)行2次 PCR 反應(yīng)很容易造成污染導(dǎo)致假陽(yáng)性，且操作相對(duì)繁瑣、費(fèi)時(shí)。熒光定量PCR技術(shù)具有可定量，自動(dòng)化程度較高，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在一些大型醫(yī)療應(yīng)用上較廣泛，但目前用于白血病BCR-ABL融合基因分析的熒光PCR法多為單項(xiàng)目檢測(cè)，檢測(cè)儀器昂貴和試劑的成本高也限制了其臨床應(yīng)用。本研究的目的在于建立一種快速、簡(jiǎn)單、成本低且能有效檢測(cè)BCRABL融合基因的方法，主要用以作為臨床早期判斷費(fèi)城染色體的輔助手段。本研究設(shè)計(jì)的檢測(cè)體系只需在1個(gè)PCR反應(yīng)管里，即可同時(shí)檢測(cè)多種BCR-ABL融合基因亞型，操作更加方便，且極大的降低了試劑成本。此外，本研究采用毛細(xì)管電泳作為檢測(cè)系統(tǒng)，自動(dòng)化程度高，可一次性快速檢測(cè)大批量的樣本，樣本量消耗少(進(jìn)樣量最小為0.5μL)，能同時(shí)生成電泳圖以及色譜圖，通過(guò)分析軟件可直接讀出樣本擴(kuò)增長(zhǎng)度，若結(jié)合自動(dòng)判讀程序，可直接判斷出具體的BCR-ABL融合基因亞型。本法可在3 h內(nèi)完成從標(biāo)本核酸提取到電泳出結(jié)果，給出檢測(cè)報(bào)告，完全滿足臨床檢測(cè)要求。初步的性能分析顯示建立的PCR法其檢測(cè)靈敏度高、特異性好;模擬樣本顯示其具有多重檢測(cè)能力，可1次性檢測(cè)出臨床上多種融合亞型共存的患者;與骨髓細(xì)胞染色體核型分析一致性好。

費(fèi)城染色體的形成即是位于9號(hào)染色體上q34區(qū)的ABL基因3端斷裂片段連接到22號(hào)染色體上q11區(qū)的BCR基因5端斷裂處，融合形成新型基因BCR-ABL。BCR和ABL基因斷裂點(diǎn)并不止一種，故會(huì)產(chǎn)生不同的融合形式，最常見(jiàn)的就是ABL基因內(nèi)含子1和BCR基因內(nèi)含子1、13或者14位置斷裂后融合形成的轉(zhuǎn)錄子e1a2、e13a2或 e14a2。其中 e1a2編碼 190-kD蛋白 P190，e13a2和e14a2編碼1種210-kD蛋白，即 P210，這2種融合形式在CML細(xì)胞中以1種存在或共存(5%)[2]。這些融合形式編碼的融合蛋白都是一種酪氨酸激酶，但因其結(jié)構(gòu)的差異使得它們?cè)谂R床特征，對(duì)藥物的反應(yīng)性以及預(yù)后方面并不相似，因此清晰的區(qū)分各融合形式對(duì)于藥物選擇以及療效評(píng)價(jià)方面都具有重要意義。染色體核型分析技術(shù)雖可辨別出染色體異?，F(xiàn)象，但卻并不清楚具體異常，PCR法則可針對(duì)不同的融合模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)來(lái)具體區(qū)分。融合模板通?？蓮募?xì)胞或質(zhì)粒中獲得，但一種陽(yáng)性細(xì)胞系只對(duì)應(yīng)一種融合形式，故多種融合模板檢測(cè)需要足夠的細(xì)胞系，這無(wú)疑增加了實(shí)驗(yàn)的成本。因此，本研究采用了重疊PCR法來(lái)構(gòu)建融合基因陽(yáng)性模板(e1a2、e13a2和e14a2)，其原理見(jiàn)圖6。它的特點(diǎn)就是在2條基因連接處的引物設(shè)計(jì)中添加了能夠與對(duì)方基因互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列尾巴，從而通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將兩條基因連接起來(lái)，且連接處無(wú)添加額外堿基。所以構(gòu)建融合基因模板的引物設(shè)計(jì)尤為重要，根據(jù)這3種融合形式(e1a2、e13a2和e14a2)具體的融合點(diǎn)，才能獲得準(zhǔn)確的融合模板。根據(jù)本研究的方案，可設(shè)計(jì)出各種可能融合模式的檢測(cè)方法，用于CML分子發(fā)病機(jī)制研究。

圖6 重疊延伸PCR法原理

本法在CML診斷分型、藥物選擇上具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，但在微小殘留性疾病監(jiān)測(cè)上還有待進(jìn)一步研究。課題組正不斷搜集各類、各期CML樣本，包括典型和非典型的，初/復(fù)診、復(fù)發(fā)型等。在后續(xù)工作中，將以所構(gòu)建的各融合基因(e1a2、e13a2、e14a2)模板穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到陰性HL-60細(xì)胞系中，與正常血液混合后采用本方法定性、定量檢測(cè)每mL血液中的異常細(xì)胞數(shù)，為本方法在微小殘留性疾病的分析和檢測(cè)監(jiān)測(cè)上提供進(jìn)一步的性能評(píng)價(jià)。此外，費(fèi)城染色體雖是CML的標(biāo)志，存在于95%以上的CML患者中，但在急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，急性髓性細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者中也有顯著的發(fā)生率。其中e1a2主要存在于70%Ph+ALL 以及少數(shù) CML、AML 細(xì)胞中[15]，e13a2和e14a2則主要存在于95%以上的CML和25%以上的Ph+ALL細(xì)胞中[16]。因此，本研究建立的多重RT-PCR方法同樣也適用于BCRABL陽(yáng)性的ALL以及AML患者的早期診斷。總之，本研究建立了一種快速、簡(jiǎn)便、價(jià)廉的多重RT-PCR檢測(cè)BCR-ABL融合基因常見(jiàn)亞型的方法，該方法適合臨床上CML的輔助診斷、分子分型和治療方案選擇。

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