李 頎，王 巖，邱一凡，董 玲，陳克林

(大慶油田總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶163001)

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，是一種常見的多因子的代謝病，其發(fā)病原因是由環(huán)境和遺傳因素共同作用。在不同種族人群中，T2DM的發(fā)病率都在持續(xù)增長，影響到各個(gè)年齡段的人群[1-2]。基因?qū)W的研究一致認(rèn)為糖尿病是一個(gè)家族性的疾病。雖然目前對糖尿病有較多的全基因組范圍關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWAS)，T2DM 的易感基因還是不清楚[3-13]。

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥。DN引發(fā)的終末期腎病(ESRD)已成為威脅糖尿病患者生命的主要原因。DN是造成1型糖尿病和T2DM致死的主要原因[14]。DN的發(fā)生發(fā)展受環(huán)境和遺傳因素的協(xié)同作用。

ALOX12是脂氧合酶超家族成員之一，在有氧條件下，催化多不飽和脂肪酸底物(包括花生四烯酸和亞油酸)形成氫基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETE)。ALOX12基因位于染色體17p13.1，由14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子組成[15-16]。根據(jù)該基因的功能推測其與糖尿病的發(fā)生有關(guān)，這一觀點(diǎn)也被研究證實(shí)[15，17-18]。在歐美人群中開展的研究已發(fā)現(xiàn)ALOX12基因多態(tài)性與T2DM易感性之間存在相關(guān)性[17]，ALOX12基因R261Q位點(diǎn)的突變會(huì)顯著增加DN蛋白尿癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[15]。

盡管ALOX12基因與T2DM的關(guān)系已有研究，但是關(guān)于漢族人群的該基因在T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中的作用至今未見報(bào)道。T2DM以及DN在中國人群的發(fā)病率中占有很大比例，因此研究ALOX12基因與DN的關(guān)系具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。Burdon等[19]研究發(fā)現(xiàn)，一種ALOX12基因的編碼突變會(huì)導(dǎo)致氨基酸261位置上1個(gè)精氨酸被谷氨酸替代(Arg261Gln)，該位點(diǎn)為 rs1126667，位于ALOX12基因6號外顯子上。我們選取這一位點(diǎn)作為研究對象，探討ALOX12基因多態(tài)性與中國漢族人群T2DM腎病易感性關(guān)系。

材料和方法

一、對象

采用病例-對照的方法。研究對象共343例，分為病例組和正常對照組。其中病例組為223例T2DM患者，均按照世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年公布的和2003年國際糖尿病專家委員會(huì)建議的標(biāo)準(zhǔn)診斷[20]。該組又分為2個(gè)亞組:(1)DN組134例，男75例，女59例，DN診斷標(biāo)準(zhǔn)為持續(xù)蛋白尿，間隔1個(gè)月以上連續(xù)測定尿蛋白，尿中白蛋白排泄率＞300 mg/24 h，或糖尿病合并腎功能不全，并排除由心臟、肝臟及其他全身疾病引起蛋白尿、原發(fā)泌尿系統(tǒng)疾病和應(yīng)用影響腎功能藥物者;(2)T2DM無腎病組89例，男52例，女37例，尿中白蛋白排泄率＜30 mg/24 h。正常對照組為120名健康人，男61名，女59名。研究對象均屬于東北漢族人群，病例組選自東北地區(qū)大慶油田總醫(yī)院內(nèi)分泌科住院患者。正常對照組為大慶油田總醫(yī)院同期健康體檢人員120名，無糖尿病、高血壓和腎病家族史，在年齡選擇上與糖尿病病例組相一致。所有受檢者相互間無血緣關(guān)系，抽血前簽署知情同意書，填寫一般資料調(diào)查表。

二、DNA 的提取

樣本為外周血2 mL。用DNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit)提取 DNA(按說明書操作)，DNA保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

三、引物設(shè)計(jì)

從Hapmap數(shù)據(jù)庫上的標(biāo)簽SNP中選擇ALOX12基因Arg261Gln上1個(gè)位點(diǎn)rs1126667。

根據(jù)ALOX12基因的目標(biāo)序列和所選擇的多態(tài)性位點(diǎn)，利用Sequenom MassARRAY Assay Design 3.0軟件設(shè)計(jì)這個(gè)位點(diǎn)的多重PCR特異性擴(kuò)增引物和延伸引物。引物序列見表1。

表1 ALOX12基因rs1126667位點(diǎn)引物序列

五、基因分型分析

提取純化后的基因組DNA樣品濃度A260nm/A280nm比值為1.7 ～1.9，按設(shè)計(jì)順序加樣于384 孔板上，然后加PCR擴(kuò)增體系使反應(yīng)物的終濃度如下:Taq聚合酶0.1 U，基因組 DNA 5 ng，PCR 引物 2.5 pmol，dNTP 2.5 mmol。PCR 反應(yīng)條件:95℃ 15 min，然后45個(gè)循環(huán)的95℃ 20 s、56℃30 s、72℃ 30 s。剩余的dNTP經(jīng)添加0.3 U的堿性磷酸酶去除。單堿基延伸反應(yīng)通過添加5.4 pmol延伸引物，50 μmol dNTP/ddNTP 混合物，0.5 U Thermosequenase DNA 聚合酶，反應(yīng)條件為94℃ 2 min，然后94℃ 5 s、50 ℃ 5 s、72 ℃5 s 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物用樹脂脫鹽20min后經(jīng)自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于SpectroCHIP(Sequenom)芯片。點(diǎn)樣后的芯片用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SpectroREADER，Sequenom)檢測。ALOX12基因rs1126667 SNP 3種基因型圖譜見圖1。

圖1 ALOX12 rs1126667位點(diǎn)3種基因型圖譜

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對基因型分布頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Logisitic回歸以消除年齡對統(tǒng)計(jì)的影響。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析和互聯(lián)網(wǎng)上的 SNPstats(http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)進(jìn)行分析[21]。

結(jié) 果

一、各組一般臨床資料和檢測結(jié)果比較

正常對照的性別構(gòu)成與病例組相匹配。正常對照組和DN組性別構(gòu)成、身高、體重指數(shù)(BMI)及膽固醇差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

與正常對照組相比，DN組年齡、體重、血壓、尿素氮、空腹血糖、肌酐、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01、P ＜0.05);T2DM 無腎病組年齡、體重、舒張壓、尿素、空腹血糖、甘油三酯及低密度脂蛋白膽固醇差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

二、各組ALOX12基因rs1126667位點(diǎn)基因型分析

T2DM組和正常對照組ALOX12基因rs1126667位點(diǎn)的等位基因頻率分布見表3。正常對照組和T2DM組等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

表2 各組一般情況比較 (±s)

表2 各組一般情況比較 (±s)

注:與正常對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與 DN 組比較，#P ＜0.01;△表示自然對數(shù)

組別 例數(shù) 性別(男/女)年齡(歲) 身高(cm) 體重(kg) 收縮血壓(kPa) 舒張血壓(kPa)正常對照組 120 61/59 52.8 ±6.4 165.93 ±7.69 64.55 ±9.86 15.70 ±1.60 10.50 ±1.06 DN 組 134 75/59 59.3 ±12.4 166.79 ±7.50 70.93 ±15.34＊＊ 19.20 ±4.52＊＊ 11.00 ±1.89＊＊T2DM 無腎病組 89 52/37 56.8 ±11.8 166.83 ±7.73 69.77 ±11.56＊＊ 19.20 ±3.32＊＊ 10.71 ±1.48組別 例數(shù) BMI(kg/m2) 血清尿素(mmol/L) 空腹血糖(mmol/L) 餐后2 h血糖(mmol/L)120 23.45 ±1.23 5.26 ±1.16 4.8 ±0.48 5.71 ±1.18 DN 組 134 25.50 ±2.89＊＊ 11.71 ±8.71＊＊# 10.79 ±4.52＊＊ 14.56 ±5.31＊＊T2DM 無腎病組 89 25.07±1.62＊＊ 6.52±2.12＊＊# 9.48±3.8＊＊ 13.93±4.63＊＊組別 例數(shù) 糖化血紅蛋白(%) 肌酐(μmol/L)△ 膽固醇(mmol/L)△ 甘油三酯(mmol/L)正常對照組△正常對照組 120 5.24 ±0.50 4.16 ±1.50 1.58 ±0.19 0.47 ±0.097 DN 組 134 7.69 ±0.20＊＊ 5.28 ±1.67＊＊ 1.68 ±0.32 0.98 ±0.072＊＊T2DM 無腎病組 89 8.5 ±1.26＊＊# 4.14 ±1.22# 2.04 ±1.21# 0.95 ±0.039＊＊#組別 例數(shù) 高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)△低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)△ C肽(nmol/L)# 胰島素(pmol/L)△正常對照組 120 0.27 ±0.013 0.97 ±0.06 0.49 ±0.10 3.26 ±0.23糖尿病腎病組 134 0.13±0.039＊＊ 1.01±0.320* 1.2±0.160＊＊ 5.25±1.50*2 型糖尿病無腎病組 89 0.19 ±0.028*# 1.13 ±0.240＊＊# 1.03 ±1.00＊＊ 4.53 ±1.54*#

表3 正常對照組與T2DM組rs1126667位點(diǎn)等位基因頻率分布 [例(%)]

對ALOX12基因的rs1126667位點(diǎn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，然后行χ2檢驗(yàn)。如果位點(diǎn)在對照組中不符合Hardy-Weinberg平衡，我們通常會(huì)懷疑該位點(diǎn)的基因型鑒定的質(zhì)量;如果該位點(diǎn)在對照組平衡而在病例組出現(xiàn)不平衡，則該位點(diǎn)很可能和疾病有關(guān)。T2DM組和正常對照組ALOX12基因rs1126667位點(diǎn)等位基因型頻率和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果顯示該位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡定律，樣本基因型檢測結(jié)果經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，具有群體代表性(P＞0.05)。

三、各組Logistic回歸分析

運(yùn)用廣義模型，對rs1126667位點(diǎn)進(jìn)行Logistic回歸分析，對年齡和性別做了校正后，計(jì)算相對危險(xiǎn)度[OR(95%CI)]。結(jié)果顯示T2DM組、DN組、T2DM無腎病組與正常對照組之間OR值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表5。T2DM無腎病組與T2DM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見表 6。

表4 正常對照組與T2DM組rs1126667位點(diǎn)基因型分布 [例(%)]

表5 正常對照組與T2DM組rs1126667位點(diǎn)與疾病的相關(guān)度(校正年齡和性別) [OR(95%CI)]

表6 T2DM無腎病組及DN組rs1126667位點(diǎn)與疾病相關(guān)度(校正年齡和性別)

討 論

T2DM是一種具有明顯遺傳傾向的多基因疾病，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是由遺傳、環(huán)境、行為多種因素共同參與、相互作用促成發(fā)生的一種多因子代謝病。

ALOX12是脂氧合酶超家族成員之一，在有氧條件下，催化多不飽和脂肪酸底物(包括花生四烯酸和亞油酸)形成氫基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoic acid，HETE)。研究表明，多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)能通過改變細(xì)胞膜成分、細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平以及花生酸產(chǎn)物進(jìn)而影響調(diào)控脂代謝基因的表達(dá)，同時(shí)PUFAs及其代謝產(chǎn)物還可以通過結(jié)合不同的細(xì)胞核受體及轉(zhuǎn)錄因子影響基因轉(zhuǎn)錄。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR)是一種細(xì)胞核受體，已知有3種類型。已經(jīng)被證實(shí)能夠與PUFAs及其代謝產(chǎn)物相互作用，并在調(diào)控脂代謝相關(guān)基因表達(dá)中起重要作用[22]。其中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)是重要的條件脂聯(lián)素和胰島素敏感、脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)因子，在脂肪細(xì)胞分化、肥胖易感性和胰島素抵抗中起重要的作用[18，23]。與其功能相近的基因在此方面已經(jīng)有類似的研究[24-25]。根據(jù)該基因的功能推測其與糖尿病的發(fā)生有關(guān)，這一觀點(diǎn)也被研究證實(shí)。在歐美人群中開展的研究已發(fā)現(xiàn)ALOX12基因多態(tài)性與 T2DM易感性之間存在相關(guān)性[17]，ALOX12基因Arg261Gln位點(diǎn)的突變會(huì)顯著增加DN蛋白尿癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，其多態(tài)性與歐美人群DN的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)[15]。

ALOX12基因位于染色體17p13.1，由14個(gè)外顯子和 13 個(gè)內(nèi)含子組成[15]。Burdon 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，一種 ALOX12基因的編碼，位點(diǎn)為rs1126667，位于ALOX12基因6號外顯子上，當(dāng)G轉(zhuǎn)換成A時(shí)，會(huì)導(dǎo)致氨基酸261位置上1個(gè)精氨酸被谷氨酸替代(Arg261Gln)。本實(shí)驗(yàn)選取這一位點(diǎn)作為研究對象，探討ALOX12基因多態(tài)性與中國漢族人群T2DM腎病易感性關(guān)系。

ALOX12基因與DN的關(guān)系已經(jīng)在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以及人體實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)。動(dòng)物模型中一系列研究數(shù)據(jù)表明，脂氧合酶12(12-lipoxygenase，12LO)與高血糖癥引起的腎病密切相關(guān)[26]。當(dāng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞和腎小囊臟層細(xì)胞置于高濃度葡萄糖溶液環(huán)境中，12LO mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平含量激增。激增的12LO和HETE能夠誘導(dǎo)腎臟組織細(xì)胞肥大以及腎小球系膜細(xì)胞外纖連蛋白的表達(dá)[26-28]。而DN與腎小球系膜細(xì)胞的增厚、腎小球細(xì)胞的肥大以及腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)的沉積有關(guān)[14]。由此推測12LO與DN的發(fā)生有關(guān)。人體中的花生四烯酸 12-脂氧合酶ALOX12和動(dòng)物的12LO結(jié)構(gòu)功能相似，可能參與DN的致病機(jī)理。Meirhaeghe等[23]研究證實(shí)在不同種族人群 PPAR-γ基因多態(tài)性(最常見為Pro12Ala)與T2DM易感性相關(guān)。而ALOX12的催化底物(花生四烯酸、亞油酸)及其催化產(chǎn)物是PPAR內(nèi)源性配體，由此推測 ALOX12基因與T2DM的發(fā)病有關(guān)。Liu等[15]在研究ALOX12與T2DM蛋白尿癥的血糖控制關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，ALOX12基因p.Arg261Gln位點(diǎn)的突變會(huì)顯著增加糖尿病腎病蛋白尿癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);ALOX12基因多態(tài)性與歐美人群的DN發(fā)病機(jī)理關(guān)系密切。然而該位點(diǎn)的突變與DN的確切關(guān)系還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

本研究探討了東北漢族人群中ALOX12基因的rs1126667位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM和DN的關(guān)聯(lián)性。研究發(fā)現(xiàn)該基因的rs1126667位點(diǎn)多態(tài)性和T2DM及DN不相關(guān)。而Kasinath等[29]在歐美人群中的研究中發(fā)現(xiàn)，ALOX12基因多態(tài)性與T2DM存在相關(guān)性。這種不一致性可能是由于種群與地理位置不同造成。不同地區(qū)的人種群具有不同的發(fā)展歷史。所以采用不同的人群進(jìn)行研究，得到的結(jié)果可能不同。另外，對于ALOX12基因多態(tài)性與糖尿病的相關(guān)性研究主要集中在 rs1126667位點(diǎn)，可能也會(huì)出現(xiàn)在其它位點(diǎn)對該基因與疾病相關(guān)性的研究。后續(xù)研究中需要擴(kuò)大該基因的研究位點(diǎn)，同時(shí)可選取更大的范圍，擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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