賈新平，葉曉青，梁麗建，鄧衍明，孫曉波，佘建明

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014）

海濱雀稗（Paspalumvaginatum，Seashore paspalum）是禾本科（Gramineae）黍族（Paniceae）雀稗屬（Paspalum）的多年生草本植物，原產(chǎn)于美洲，為潮間帶草灘植被的主要組分［1－2］。海濱雀稗是目前耐鹽能力最強(qiáng)的草坪草種，還具有較強(qiáng)的耐澇、耐旱、耐踐踏和耐磨損特性，能在復(fù)雜的逆境條件下生長(zhǎng)［3－8］。海濱雀稗的葉色翠綠，景觀效果優(yōu)于狗牙根（Cynodondactylon）、結(jié)縷草（Zoysiajaponica）和假儉草（Eremochloaophiuroides）等暖季型禾草，作為草坪草在世界熱帶與亞熱帶地區(qū)廣為種植，已成為21世紀(jì)最具發(fā)展?jié)摿Φ牟萜翰莘N［9］。同時(shí)，海濱雀稗還具有良好的適口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可作為優(yōu)良牧草加以利用［10］。關(guān)于海濱雀稗的遺傳多樣性、分子標(biāo)記輔助育種等研究已有報(bào)道［11－12］，但其基因組和轉(zhuǎn)錄組信息的缺乏，造成海濱雀稗分子標(biāo)記開發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建、生長(zhǎng)發(fā)育及其抗逆機(jī)理方面的研究相對(duì)滯后［13］。

近年來，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等各種組學(xué)技術(shù)在揭示細(xì)胞生理活動(dòng)規(guī)律和生物代謝機(jī)理的研究中起著越來越重要的作用，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)是率先發(fā)展起來以及應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)［14］。轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指細(xì)胞在特定狀態(tài)下全部表達(dá)的RNA的總和，反映相同基因在不同條件下表達(dá)水平的差異，并能揭示不同基因的相互作用及各自功能［15］。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能全面快速地獲得某一物種特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下的基因表達(dá)情況，用于研究基因結(jié)構(gòu)和功能、可變剪接和新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)等［16－20］。相對(duì)于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺(tái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序無需已知序列設(shè)計(jì)探針，可對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，提供更精確的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍。對(duì)于許多缺乏基因組信息的物種而言，轉(zhuǎn)錄組研究已在非模式植物中得到了廣泛應(yīng)用［21－26］。

盡管海濱雀稗具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，但其分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢，基因數(shù)據(jù)庫(kù)資源也十分匱乏。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，極大地促進(jìn)了植物基因表達(dá)研究，這樣不僅可降低測(cè)序的成本和時(shí)間，而且還可以獲得豐富的數(shù)據(jù)，有利于植物生長(zhǎng)發(fā)育及其抗逆等方面的研究［27］。到目前為止，利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行草坪種質(zhì)資源創(chuàng)新與開發(fā)的研究還未見報(bào)道。本研究首次將Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到草坪草轉(zhuǎn)錄組研究中，將測(cè)序得到的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接與組裝，結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)所獲得的unigene進(jìn)行基因功能注釋、功能分類、代謝途徑等分析，從功能基因組水平上研究海濱雀稗生長(zhǎng)發(fā)育過程中重要基因的表達(dá)，同時(shí)也為進(jìn)一步的分子標(biāo)記開發(fā)和基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為海濱雀稗品種“Adalayd”，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所植物細(xì)胞工程課題組提供。試驗(yàn)于2013年8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所溫室中進(jìn)行，選取長(zhǎng)勢(shì)良好、健康的植株葉片，迅速將其放入紙帶內(nèi)，立即經(jīng)液氮速凍后保存于實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱中備用。

1．2 RNA提取

利用TRIzoL法提取試驗(yàn)材料海濱雀稗葉片的總RNA。將樣品放入研缽，加適量液氮迅速研磨，轉(zhuǎn)移到經(jīng)DEPC處理的2mL離心管中，加入1mL TRIzoL（Invitrogen，CarLsbad－CA92008，USA），旋渦振蕩混勻，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心10min，將上清液移入新的1．5mL離心管，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液，用力搖15s，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心10min，將上清液移至新的1．5mL離心管，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心15min，去除上清液，用RNase－free水配制的75%乙醇洗滌；4℃、12000r／min離心15min，去除上清液；置于冰上自然干燥5min，用RNase－free水溶解，保存于－70℃?zhèn)溆?。用AgiLent 2100BioanaLyzer檢測(cè)RNA提取質(zhì)量，RIN值≥7．0。

1．3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)組裝

提取樣品總RNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。首先加入破碎緩沖液將mRNA打斷成短序列，以這些短序列為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈。cDNA經(jīng)過試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly（A）并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行序列大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫(kù)用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序。采用Illumina兩個(gè)末端（PE）測(cè)序法，最初的原始序列為100bp。原始的測(cè)序結(jié)果去除制備文庫(kù)時(shí)產(chǎn)生的接頭序列、兩端低質(zhì)量序列和低度復(fù)雜序列，再利用SOAPdenovo軟件進(jìn)行序列拼接［26］，之后通過連接兩末端和填補(bǔ)空位，將拼接成的重疊群（Contig），進(jìn)一步組裝成unigene。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的原始序列信息已提交到NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)（SRA BioProject：SRX383837）。

1．4 功能注釋、分類和代謝途徑分析

采用序列比對(duì)的方法對(duì)unigene進(jìn)行序列相似性分析，使用BLAST程序?qū)⑵唇拥玫降膗nigene與核酸、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（E值≤1×10－10），選取最佳的功能注釋。核酸數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBI的非冗余核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（non－redundant nucleotide database，Nt），蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)包括 NCBI的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（non－redundant protein database，Nr）和SwissProt（swissprot protein sequence database）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋信息，使用Blast2GO軟件［27］得到unigene的GO條目，然后用WEGO軟件［28］對(duì)所有的unigene進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì)。然后對(duì)unigene分別進(jìn)行蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)（cluster of orthologous groups，COG）功能分類和京東基因與基金組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝途徑分析。

1．5 SSR位點(diǎn)搜索及分析

對(duì)海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組中的unigene序列進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）位點(diǎn)搜索，搜索標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)?、二、三、四、五、六核苷酸基序（motif）至少重復(fù)次數(shù)分別為10，8，5，4，3，3，對(duì)查找的SSR類型進(jìn)行特征分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝

采用Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)海濱雀稗葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，共得到47520544個(gè)reads片段，每個(gè)reads的長(zhǎng)度為100bp，即測(cè)序獲得了4752054400bp（4．75Gb）的序列信息。采用SOAPdenovo軟件對(duì)reads序列聚類進(jìn)行拼接，共獲得966165個(gè)contig序列。其中，長(zhǎng)度50～100bp的contig序列有761498個(gè)，占總體的78．82%；100～200bp的contig序列有125173個(gè)，占總體的12．96%；而≥200bp的contig序列有79494個(gè)，占總體的8．22%（表1）。由此可見，contig序列主要以長(zhǎng)度為50～100bp為主，完全符合Illumina測(cè)序的預(yù)期結(jié)果，為后續(xù)的數(shù)據(jù)組裝提供很好的原始數(shù)據(jù)。

在contig數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行組裝，共獲得81220個(gè)unigene，序列信息達(dá)到了87542503bp（87．54Mb），序列大小為201～16328bp，平均長(zhǎng)度為1077bp，N50為1680bp。其中，長(zhǎng)度200～500bp的unigene有29325個(gè)，占總體的36．11%；500～1000bp的unigene有18341個(gè)，占總體的22．58%；≥1000bp的unigene有33554個(gè)，占總體的41．31%（表2）。

表1 海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組contig數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Data assembly for contig in the transcriptome of P． vaginatum

表2 海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組unigene數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 2 Data assembly for unigene in the transcriptome of P． vaginatum

表3 海濱雀稗unigene的GC含量統(tǒng)計(jì)Table 3 Data assembly for GC content of P． vaginatumunigene

GC含量是基因組堿基序列的重要特征之一，能反映基因的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化信息，GC分布不均勻?qū)е禄蚪M不同GC含量序列其性質(zhì)和功能也有差異。海濱雀稗unigene的GC平均含量為49．98%，其中GC含量40%～60%的unigene（59903個(gè)）占總體的73．75%，GC含量20%～40%的unigene（6552個(gè)）占總體的8．07%，GC含量60%～80%的unigene（14765個(gè)）占總體的18．18%，而GC含量過高（大于80%）或過低（小于20%）的unigene不存在，表明GC含量基本呈正態(tài)分布（表3）。

用RPKM方法計(jì)算unigene的表達(dá)水平，可消除基因長(zhǎng)度差異和測(cè)序深度的影響［29］。海濱雀稗全部unigene的RPKM平均值為28．68，最大值為50812．5（unigene 42358）。281個(gè)unigene的RPKM 值大于500，其中許多基因參與到海濱雀稗的多種生理活動(dòng)和代謝過程中。91個(gè)unigene的RPKM值低于0．2，說明Illumina HiSeq 2000能夠檢測(cè)到極低水平的基因表達(dá)。

2．2 unigene的功能注釋、分類和代謝途徑分析

2．2．1 unigene的序列相似性分析 使用BLAST程序?qū)⒔M裝得到的unigene與Nr、Nt、SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行unigene的序列相似性分析。結(jié)果表明，38446個(gè)unigene在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有22629個(gè)（占總體的58．86%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有15817個(gè)（占總體的41．14%）；相似序列匹配的近緣物種中，高粱（Sorghumbicolor）所占比例最高（45．76%），隨后依次是玉米（Zeamays，38．68%）、水稻（Oryzasativa，8．91%）、小麥（Triticumaestivum，2．45%）和其他物種（4．20%）（圖1）。46169個(gè)unigene在Nt數(shù)據(jù)庫(kù)中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有28599個(gè)（占總體的61．94%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有17570個(gè)（占總體的38．06%）；相似序列匹配的近緣物種中，高粱所占比例最高（62．72%），隨后依次是玉米（25．82%）、水稻（3．81%）、短柄草（Brachypodiumdistachyon，2．11%）和其他物種（5．54%）。24471個(gè)unigene在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有8742個(gè)（占總體的35．72%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有15729個(gè)（占總體的64．28%）；相似序列匹配的近緣物種中，擬南芥（Arabidopsisthaliana）所占比例最高（46．03%），隨后依次是水稻（20．10%）、玉米（8．30%）、小麥（3．73%）和其他物種（21．84%）（圖1）。由于缺乏海濱雀稗的基因組、EST和蛋白序列信息，部分unigene在數(shù)據(jù)庫(kù)中無法匹配到已知基因。

圖1 海濱雀稗unigene的序列相似性分析Fig．1 Characteristics of homology search of P． vaginatumunigene

2．2．2 unigene的GO分類 基因本體論（gene ontology，GO）是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類數(shù)據(jù)庫(kù)，用于全面地描述不同生物中基因的生物學(xué)特征。結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)海濱雀稗的unigene進(jìn)行功能分類，從宏觀上認(rèn)識(shí)海濱雀稗表達(dá)基因的功能分布特征。GO數(shù)據(jù)庫(kù)包括3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的本體，分別描述所處的細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和參與的生物學(xué)過程（biological process）。研究結(jié)果表明，可將海濱雀稗unigene劃分為48個(gè)功能組，并對(duì)每個(gè)功能組涉及的unigene進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。從圖2中可以看出，51497個(gè)unigene歸屬于細(xì)胞組分，22718個(gè)unigene歸屬于分子功能，60856個(gè)unigene歸屬于生物學(xué)過程，這一分類結(jié)果顯示了海濱雀稗生長(zhǎng)過程中基因表達(dá)譜的總體情況。其中，“細(xì)胞成分”（18763個(gè)）、“細(xì)胞進(jìn)程”（17347個(gè)）、“代謝進(jìn)程”（13891個(gè)）和“結(jié)合活性”（10726個(gè)）功能組中涉及的unigene較多，而“翻譯調(diào)節(jié)活性”（7個(gè)）、“金屬伴侶蛋白活性”（4個(gè)）、“氮素利用”（2個(gè)）和“蛋白標(biāo)簽”（2個(gè)）功能組中涉及的unigene較少。

2．2．3 unigene的COG功能分類 蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)（cluster of orthologous groups，COG）是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。將海濱雀稗unigene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)unigene功能并進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。研究結(jié)果表明，海濱雀稗unigene根據(jù)其功能大致可分為25類，并對(duì)每類的unigene進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（圖3中用A～Z表示）。從圖中可以看出，unigene涉及的COG功能類別比較全面，涉及了大多數(shù)的生命活動(dòng)。其中，一般功能預(yù)測(cè)類基因最多（4716個(gè)）；其次是未知功能類基因（3306個(gè)）、翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生類基因（2662個(gè)）、翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶類基因（2247個(gè)）和碳水化合物運(yùn)輸和代謝類基因（2087個(gè)）；而胞外結(jié)構(gòu)類基因（11個(gè)）和核結(jié)構(gòu)類基因較少（7個(gè)）；其他類別的基因表達(dá)豐度都各不相同。

圖2 海濱雀稗unigene的GO分類Fig．2 GO functional categories of P． vaginatumunigene

圖3 海濱雀稗unigene的COG功能分類Fig．3 COG function classification of P． vaginatumunigene

2．2．4 unigene的 KEGG分析 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑以及基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息能進(jìn)一步得到unigene的pathway注釋［30］。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)海濱雀稗的unigene可能參與或涉及的代謝途徑進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。研究結(jié)果表明，可將海濱雀稗的unigene歸屬于五大類的代謝途徑，主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂類物質(zhì)代謝、次生物質(zhì)代謝、復(fù)制與修復(fù)、轉(zhuǎn)錄與翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等19類代謝途徑（圖4）。將KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)作為參考，可將unigene定位到112個(gè)具體的代謝途徑分支。其中，涉及糖異生和糖酵解途徑的基因有140個(gè)，占總體的3．35%；磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)途徑的基因有133個(gè)，占總體的3．18%；甘油磷脂代謝途徑的基因有130個(gè)，占總體的3．11%；苯丙氨酸代謝途徑的基因有79個(gè)，占總體的1．89%；RNA降解途徑的基因有68個(gè)，占總體的1．63%；黃酮類化合物合成途徑的基因有44個(gè)，占總體的1．05%；植物與病原物互作的基因有23個(gè)，占總體的0．56%（表4）。

圖4 海濱雀稗unigene的KEGG分類Fig．4 KEGG classification of P． vaginatumunigene

2．3 SSR分析

對(duì)海濱雀稗的81220個(gè)unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共檢測(cè)到22721個(gè)SSR位點(diǎn)。SSR的類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均存在，所占比例變化較大（表5）。其中，三核苷酸重復(fù)所占比例最高，達(dá)到了31．71%；比例最低的是二核苷酸重復(fù)，僅為4．35%；五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)所占比例基本相同，分別為14．15%和14．67%。在檢測(cè)到的SSR中，出現(xiàn)頻率最高的10類基序?yàn)椋篈／T（6198個(gè)）、CCG／CGG（2992個(gè)）、AGC／CTG（1277個(gè)）、AGG／CCT（1249個(gè)）、AG／CT（776個(gè)）、ACG／CGT（516個(gè)）、AAG／CTT（415個(gè)）、ACC／GGT（376個(gè)）、AGAGG／CCTCT（259個(gè)）、AGGG／CCCT（197個(gè)）。上述SSR特征分析，有助于開展海濱雀稗及其同屬物種的基因組差異分析、通用性標(biāo)記開發(fā)和遺傳圖譜構(gòu)建的研究。

3 討論

隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，植物基因組研究得到快速發(fā)展，但草坪草基因組研究還相對(duì)較少。Illumina高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)量大、速度快、成本低、效率高［31］，適合于沒有基因組信息的海濱雀稗展開轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究?；谵D(zhuǎn)錄組學(xué)在功能基因組學(xué)研究中的重要價(jià)值，本研究應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，研究其基因表達(dá)譜和挖掘生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要表達(dá)基因。對(duì)海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，獲得了

47520544個(gè)reads序列；對(duì)reads序列進(jìn)行拼接，共獲得了966165個(gè)contig序列。在contig數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，序列組裝后得到了81220個(gè)unigene，長(zhǎng)度大小從201～16328bp，平均長(zhǎng)度為1077bp，N50值為1680bp（N50指從組裝最長(zhǎng)的unigene依次向下求長(zhǎng)度的總加和，當(dāng)累加長(zhǎng)度達(dá)到組裝長(zhǎng)度的一半時(shí)，對(duì)應(yīng)的unigene長(zhǎng)度是N50長(zhǎng)度。N50值越大，反映組裝得到的長(zhǎng)片段越多，組裝效果就越好。測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)量和數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序完成情況的重要指標(biāo)。以上研究結(jié)果表明，此次序列組裝的質(zhì)量和長(zhǎng)度可以滿足轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求，且新一代高通量測(cè)序技術(shù)是批量發(fā)現(xiàn)海濱雀稗功能基因的更為有效手段，進(jìn)一步說明Illumina HiSeq 2000是高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的可靠平臺(tái)。

表4 海濱雀稗unigene的代謝途徑分析Table 4 Analysis of metabolic pathways of P． vaginatumunigene

續(xù)表4 Continued

表5 海濱雀稗SSR不同重復(fù)基序分布及優(yōu)勢(shì)堿基組成Table 5 Distribution and compositions of the dominant repeat of the different repeat motifs for SSR

結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，對(duì)海濱雀稗unigene與Nr、Nt、SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行序列相似性和功能注釋分析。46169個(gè)unigene與其他近緣生物的已知基因具有不同程度的同源性，并且還獲得了35051個(gè)新的unigene（占總體的56．84%），表明在對(duì)海濱雀稗基因組及遺傳背景幾乎不清楚的情況下，高通量測(cè)序技術(shù)是批量發(fā)現(xiàn)海濱雀稗功能基因的有效手段。雖然GO是個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的生物信息本體數(shù)據(jù)庫(kù)，被廣泛地用于基因的注釋功能，然而由于GO結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上的缺陷以及基因的許多特征還未被發(fā)現(xiàn)，使得這種基因注釋信息尚不完全。因此，本研究中的海濱雀稗unigene基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的相關(guān)功能注釋信息還不完善，還有部分的unigene沒有賦予了可能的GO條目，有待通過其他生物信息學(xué)方法對(duì)unigene功能注釋進(jìn)一步補(bǔ)充。利用COG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)海濱雀稗unigene進(jìn)行基因功能分類，可從基因組水平上找尋直系同源體，預(yù)測(cè)未知ORF的生物學(xué)功能，可以大大提高基因功能注釋的準(zhǔn)確性。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述unigene進(jìn)行代謝途徑分析，涉及112個(gè)具體的代謝途徑分支，參與到海濱雀稗體內(nèi)的碳水化合物代謝、脂類代謝、次生物質(zhì)代謝等過程中，為進(jìn)一步大量挖掘海濱雀稗生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要表達(dá)基因，開展海濱雀稗的基因克隆及功能驗(yàn)證等研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

SSR分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、遺傳信息量大、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，已在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因發(fā)掘、分子標(biāo)記輔助育種等研究中得到了廣泛應(yīng)用［32－36］。采取實(shí)驗(yàn)室手段開發(fā)SSR引物費(fèi)時(shí)，耗力，成本高，試驗(yàn)復(fù)雜，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行SSR分子標(biāo)記開發(fā)將是一種既經(jīng)濟(jì)又有效的方法。目前，海濱雀稗可利用的分子標(biāo)記數(shù)量非常有限，轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)為SSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供了更豐富和極有價(jià)值的可利用資源。本研究通過查找發(fā)現(xiàn)了22721個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR不但出現(xiàn)頻率高，而且類型豐富。利用在線引物設(shè)計(jì)軟件共設(shè)計(jì)出8758對(duì)SSR引物，進(jìn)一步可對(duì)這些SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，篩選出擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性好的引物，為進(jìn)一步開發(fā)新的SSR標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。SSR分子標(biāo)記的開發(fā)可用于草坪草功能基因的挖掘、豐富分子標(biāo)記類型、遺傳資源評(píng)價(jià)、重要性狀的輔助選擇等研究，有助于促進(jìn)草坪草遺傳育種的發(fā)展［37－38］。

本研究首次在國(guó)內(nèi)外采用Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)建立了海濱雀稗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了大量的轉(zhuǎn)錄本信息，并對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行了序列組裝、功能注釋、代謝途徑等分析，為今后更深入研究海濱雀稗功能基因組、基因克隆及抗逆機(jī)理研究提供了極大的方便，而且該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)還可以作為今后海濱雀稗基因組的參考序列，為海濱雀稗的分子生物學(xué)研究提供寶貴的基因組數(shù)據(jù)來源。

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