韓 建，劉 濱，姜志強(qiáng)，穆小生，雷霽霖

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水魚(yú)類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071；3.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所計(jì)劃生育生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101）

1 前言

神經(jīng)肽Y（NPY）屬于胰多肽家族，此家族還包括多肽YY（PYY）、胰多肽（PP）和多肽Y（PY）等，NPY與由G蛋白偶聯(lián)受體構(gòu)成的Y受體家族密切相關(guān)[1]。并且NPY與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育以及生活行為有很大的關(guān)系[2]，尤其是動(dòng)物的攝食，是一種內(nèi)源性的促進(jìn)攝食的非常保守的神經(jīng)遞質(zhì)。NPY第一次在豬的腦部分離提取出來(lái)[3]，之后相繼在哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、兩棲動(dòng)物和魚(yú)中被鑒定檢測(cè)出來(lái)[4，5]。

NPY在心血管功能、生殖及應(yīng)激和免疫反應(yīng)中都發(fā)揮著生理效應(yīng)[6～12]，其最重要的作用是促進(jìn)攝食，這不僅在哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類和兩棲動(dòng)物中得到證明[13～15]，在魚(yú)類中同樣得到了證明[16]，由此可推斷出NPY能夠反映各物種的攝食情況。

起初，NPY在硬骨魚(yú)類中的功能僅是作為促垂體激素釋放激素來(lái)研究的[17～20]，直至1998年，開(kāi)始進(jìn)行NPY在魚(yú)類攝食和能量平衡上的研究。Silverstein等[21]對(duì)大鱗大麻哈魚(yú)和銀大麻哈魚(yú)進(jìn)行2～3周的饑餓實(shí)驗(yàn)后導(dǎo)致其下丘腦中的NPY相似信使核糖核酸（mRNA）的表達(dá)量升高。López-Pati?o等[22]對(duì)金魚(yú)進(jìn)行了研究，證明NPY可促進(jìn)金魚(yú)的攝食。之后，該觀點(diǎn)相繼在斑點(diǎn)叉尾鮰[16]、美洲擬鰈[23]和大西洋鱈[24]等中得到證明。

大菱鲆屬于鲆科、菱鲆屬，是原產(chǎn)于歐洲北海、波羅的海和地中海沿岸的一種名貴比目魚(yú)，1992年由黃海水產(chǎn)研究所引進(jìn)我國(guó)[25]。大菱鲆耐低溫、生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮美，是重要的工廠化養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。魚(yú)類攝食一直是研究的重點(diǎn)內(nèi)容，大菱鲆作為典型工廠化養(yǎng)殖魚(yú)類，適宜的投喂不僅節(jié)約餌料，而且可避免過(guò)量的餌料對(duì)水質(zhì)的污染。而NPY作為控制攝食和能量平衡的相關(guān)基因，對(duì)其結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征的研究很有必要。

本文以大菱鲆作為研究對(duì)象，克隆出NPY的全長(zhǎng)互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）序列并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；同時(shí)進(jìn)行NPY的組織特異性表達(dá)，并對(duì)大菱鲆進(jìn)行饑餓和再投喂實(shí)驗(yàn)，從而研究NPY在攝食調(diào)控中的表達(dá)情況。本文為進(jìn)一步研究NPY基因和大菱鲆攝食的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步闡明魚(yú)類攝食調(diào)控的分子機(jī)理提供了理論依據(jù)，并且建立了一個(gè)可用來(lái)研究大菱鲆攝食的分子方法，以此為基礎(chǔ)在分子水平上研究魚(yú)類最適于攝食的環(huán)境因素并研發(fā)可促進(jìn)大菱鲆攝食和生長(zhǎng)的相關(guān)技術(shù)與產(chǎn)品。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

本文所用的健康大菱鲆取自煙臺(tái)天源水產(chǎn)有限公司?？寺〖敖M織表達(dá)所用大菱鲆的平均體重為（553.35±5.15）g，平均體長(zhǎng)為（32.50±1.31）cm。活體帶回實(shí)驗(yàn)室后，采用乙醚對(duì)其進(jìn)行麻醉，置于冰上進(jìn)行解剖，迅速分離腦組織各部分和肝臟等各組織，用RNAstore樣本保存液保存后，在4℃的冰箱中保存12 h后，放入80℃的冰箱中長(zhǎng)期保存。

饑餓和再投喂實(shí)驗(yàn)所用的大菱鲆為60日齡稚魚(yú)，平均體重為（5.5±0.02） g，平均體長(zhǎng)為（2.6±0.5）cm，養(yǎng)殖水溫為15℃，正常光照，每天7點(diǎn)和17點(diǎn)各投喂1次微顆粒飼料，實(shí)驗(yàn)前馴養(yǎng)2周。

2.2 方法

2.2.1 克隆策略和引物設(shè)計(jì)

利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）Gen-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的大西洋鱈魚(yú)、點(diǎn)帶石斑魚(yú)、牙鲆和美洲擬鰈等魚(yú)類的NPY序列保守區(qū)域，并結(jié)合Primer Primer 5.0，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增核心片段的一對(duì)引物F1和R1。并根據(jù)所得的核心片段設(shè)計(jì)5′末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）所用的特異引物GSP1和進(jìn)行巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的引物NGSP1；用同樣的方法設(shè)計(jì)出3′RACE所用的特異引物GSP2和巢式引物NGSP2。

將所得到全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)定量PCR的特異引物（qF1和qR1），并根據(jù)大菱鲆內(nèi)參基因β-actin的基因序列設(shè)計(jì)引物（βf1和βr1），用于表達(dá)分析。所有引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。以上引物具體序列見(jiàn)表1。

2.2.2 大菱鲆NPY基因的克隆

使用TRIzol Reagent（Ambion）從大菱鲆下丘腦中提取出總RNA。使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳確定總RNA的完整性，利用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。使用引物F1和R1進(jìn)行中間片段的擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5m in；94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10m in。使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）對(duì)擴(kuò)增所得片段進(jìn)行分離純化，送到北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit（Clonetech）進(jìn) 行5′RACE和3′RACE，反應(yīng)程序如下：94 ℃變性30 s，68℃退火30 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72℃延伸3m in。進(jìn)行巢式PCR后獲得目的片段，經(jīng)膠回收后，克隆到pMD? 18-TVector（TaKaRa）上，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

2.2.3 序列分析

使用DNAman 6.0對(duì)開(kāi)放閱讀框（ORF）進(jìn)行分析并推導(dǎo)出氨基酸序列，利用Prot Param工具（http：//www.expasy.org/tools/protparam.htm l）預(yù) 測(cè)NPY蛋白的基本理化性質(zhì)，運(yùn)用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)所推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。運(yùn)用ClustalX 1.83對(duì)不同物種的NPY氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并用DNAstar中的MegA lign計(jì)算同源性，用MEGA4.0通過(guò)最大似然法構(gòu)建NPY的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2.2.4 大菱鲆NPY基因組織特異性表達(dá)

從大菱鲆的前腦、中腦、后腦、延髓、下丘腦、垂體、腮、心臟、肝臟、頭腎、腎、脾臟、肌肉、胃、腸及膽囊等16個(gè)組織，使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA，使用用于實(shí)時(shí)定量PCR的反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物稀釋25倍后參照TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。使用兩步法，反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，62 ℃退火26 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行溶解曲線分析以確定對(duì)目的片段是否進(jìn)行特異性擴(kuò)增。對(duì)每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，NPY基因和內(nèi)參基因β-actin使用相同的模版量。

2.2.5 大菱鲆的饑餓和再投喂實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)進(jìn)行2周的馴養(yǎng)后，最后一次投喂后進(jìn)行饑餓實(shí)驗(yàn)，共分為兩組，第一組在喂食中（0 h）及喂食后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h、48 h和72 h進(jìn)行取樣，饑餓72 h后再次投喂并且于投喂中（0 h）和喂食后2 h進(jìn)行取樣；第二組在饑餓48 h后進(jìn)行再投喂，并同樣在投喂中（0 h）和喂食后2 h進(jìn)行取樣（在喂食中取樣時(shí)允許在喂食15m in后再取樣）。取大菱鲆的下丘腦，實(shí)時(shí)定量PCR的方法如第2.2.4節(jié)所述。

2.2.6 數(shù)據(jù)分析

所得的Ct值通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算NPY基因的相對(duì)表達(dá)量，并且使用SPSS18.0的one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著）。

3 結(jié)果

3.1 大菱鲆NPY基因全長(zhǎng)cDNA序列分析及結(jié)構(gòu)特征

采用PCR技術(shù)獲得NPY基因的核心片段，再通過(guò)RACE方法得到兩端序列，進(jìn)行拼接后得到的全長(zhǎng)cDNA序列經(jīng)tblastx分析確認(rèn)為大菱鲆NPY序列。大菱鲆NPY基因cDNA全長(zhǎng)729 bp，含有70 bp 的5′非翻譯區(qū)（5′-UTR）和359 bp的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR），其中3′-UTR含有加尾信號(hào)ATTAAA及PolyA尾。ORF長(zhǎng)300 bp，編碼含99個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，N端28個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽后是由36個(gè)氨基酸組成的NPY成熟肽，后接蛋白質(zhì)水解加工位點(diǎn)Gly-Lys-Arg，剩余32個(gè)氨基酸為NPY的羧基末端旁側(cè)肽段（CPON）（見(jiàn)圖1）。NPY蛋白的分子質(zhì)量為11 301.9 Da，等電點(diǎn)p I為5.26，分子式為C516H799N131O150S2，脂肪系數(shù)（AI）為101.52，總平均輸水指數(shù)（GRAVY）為-0.284，不穩(wěn)定系數(shù)（Ⅱ）為79.96，推斷此NPY蛋白不穩(wěn)定。NPY蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由48.48%的α-螺旋、45.45%的無(wú)規(guī)卷曲、3.03%的延伸鏈和3.03%的β轉(zhuǎn)角組成。

使用DNAstar軟件對(duì)大菱鲆NPY蛋白與其他物種的同源性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示大菱鲆NPY與其他物種的同源性在53.9%～98%，其中與牙鲆的同源性最高，為98%。使用ClustalX 18.3對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如圖2所示。進(jìn)一步使用MEGA4.0構(gòu)建NPY蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖3），根據(jù)所得進(jìn)化樹(shù)分析可知，大菱鲆NPY蛋白與鰈形目（牙鲆和美洲擬鰈）和鱸形目（歐洲狼鱸和黑棘鯛）等一同位于硬骨海水魚(yú)類這一簇上，并且大菱鲆NPY蛋白與鰈形目（牙鲆和美洲擬鰈）基本處于同一分支；鯉形目（錦鯉和斑馬魚(yú)）和鯰形目（斑點(diǎn)叉尾鮰）處在硬骨淡水魚(yú)類這一簇上；軟骨魚(yú)類（石紋電鰩）、兩棲類（非洲爪蟾）、鳥(niǎo)類（紅原雞）及哺乳動(dòng)物聚合為另一簇。大菱鲆NPY的分子進(jìn)化地位與其生物學(xué)分類地位基本一致。

圖1 大菱鲆NPY的全長(zhǎng)cDNA序列及所推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of NPY from turbot

圖2 大菱鲆與其他物種NPY蛋白的氨基酸序列對(duì)比Fig.2 Contrast of the amino acid sequences of NPY from turbot and other species

圖3 根據(jù)NPY氨基酸序列使用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Maximum-likelihood phylogenetic tree constructed with the amino acid sequences of NPY

3.2 大菱鲆NPY基因的組織表達(dá)

采用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)大菱鲆16個(gè)組織中NPY的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，大菱鲆NPY基因分布廣泛，在16個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)（見(jiàn)圖4），在腦中的表達(dá)量相對(duì)較高，其中在下丘腦中的表達(dá)量最高，并與其他15個(gè)組織的表達(dá)差異顯著（P＜0.05），在肌肉、胃、腸及膽囊中的表達(dá)量相對(duì)較低，而在垂體、腮、心臟、肝臟、腎臟及脾臟中的表達(dá)量最低。

圖4 大菱鲆NPY基因的m RNA在不同組織中的表達(dá)Fig.4 Expression of NPYm RNA in different tissues of turbot

3.3 饑餓與投喂策略對(duì)大菱鲆NPY基因的表達(dá)影響

在饑餓實(shí)驗(yàn)及再投喂實(shí)驗(yàn)中，以饑餓實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)（0 h）NPY基因的mRNA表達(dá)量作為對(duì)照，設(shè)為1。饑餓實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在0～4 h內(nèi)，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，mRNA的表達(dá)量升高；在4～8 h內(nèi)，隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；在8～48 h內(nèi)，NPY基因的mRNA表達(dá)量又再次顯著升高，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)饑餓實(shí)驗(yàn)前期（0～8 h）的mRNA表達(dá)量；然而在48～72 h內(nèi)，NPY基因的mRNA表達(dá)量再次顯著下降（見(jiàn)圖5）。

圖5 饑餓對(duì)大菱鲆NPY基因的m RNA表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of starvation on the expression of NPYm RNA in turbot

再投喂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，饑餓48 h及72 h后再投喂，NPY基因的mRNA表達(dá)量相對(duì)于正常投喂組顯著升高，但同時(shí)又于投喂2 h后呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)（見(jiàn)圖6）。

圖6 饑餓后再投喂對(duì)大菱鲆NPY基因的m RNA表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of refeeding after starvation on the expression of NPYm RNA in turbot

4 討論

本文通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和RACE技術(shù)，從大菱鲆的腦組織中得到全長(zhǎng)為729 bp的NPY cDNA序列，編碼99個(gè)氨基酸組成的NPY蛋白，其中36個(gè)氨基酸組成NPY的成熟肽，這與其他物種的結(jié)果一致[3]。大菱鲆NPY的氨基酸序列跟其他魚(yú)類相比，表現(xiàn)出較高的同源性，特別是與同屬于鲆鰈魚(yú)類的牙鲆及美洲擬鰈的同源性高達(dá)97%～98%。并且根據(jù)所得進(jìn)化樹(shù)分析可知，大菱鲆NPY蛋白位于硬骨海水魚(yú)類這一分支上，與鰈形目（牙鲆和美洲擬鰈）和鱸形目（歐洲狼鱸和黑棘鯛）等的關(guān)系較近；與鯉形目（鯉魚(yú)和斑馬魚(yú)）、鯰形目（斑點(diǎn)叉尾鮰）、軟骨魚(yú)類（石紋電鰩）、兩棲類（非洲爪蟾）、鳥(niǎo)類（紅原雞）及哺乳動(dòng)物的關(guān)系較遠(yuǎn)，這與同源性分析基本一致。在大菱鲆NPY成熟肽中不含半胱氨酸（C），只在信號(hào)肽第21個(gè)氨基酸位點(diǎn)上有一個(gè)半胱氨酸（C），并且在序列比對(duì)結(jié)果中，信號(hào)肽的第21個(gè)氨基酸位點(diǎn)上都為半胱氨酸（C）。比對(duì)結(jié)果顯示，NPY成熟肽的36個(gè)氨基酸中有26個(gè)高度保守，這說(shuō)明NPY是一種進(jìn)化十分保守的神經(jīng)肽。

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，NPY基因在大菱鲆神經(jīng)組織特別是下丘腦中的表達(dá)量較高，這與其他物種的研究結(jié)果一致。下丘腦外側(cè)區(qū)（LHA）為攝食中樞（也稱饑餓中樞），起著決定發(fā)動(dòng)攝食活動(dòng)的作用；腹內(nèi)側(cè)核（VMH）為飽食中樞，起著決定停止進(jìn)食活動(dòng)的作用[26]。NPY基因mRNA在下丘腦中的表達(dá)最高，說(shuō)明NPY可能與攝食和能量平衡的調(diào)節(jié)有關(guān)。NPY在神經(jīng)組織中的表達(dá)量較高，在外周組織中也有表達(dá)，但不同物種間外周組織中NPY的表達(dá)量略有不同。在大菱鲆外周組織中NPY在肌肉、胃、腸及膽囊中的表達(dá)量相對(duì)于在垂體、腮、心臟、肝臟、腎臟及脾臟中的表達(dá)量較高，由此可推斷在大菱鲆中NPY可能是腦-腸肽，這在其他魚(yú)類中已得到相應(yīng)的證明[24，27～29]。在腎臟中也檢測(cè)到了NPY的存在，由此可得出NPY有可能與大菱鲆的滲透調(diào)節(jié)有關(guān)。大菱鲆NPY基因在消化系統(tǒng)（胃和腸）中的表達(dá)是除中樞系統(tǒng)（腦部等）外表達(dá)量最高的，這與其他物種的研究結(jié)果相一致[6]。

饑餓實(shí)驗(yàn)中，隨著饑餓的進(jìn)行，NPY的表達(dá)量顯著變化（P＜0.05），呈現(xiàn)先升高再降低，再顯著升高并維持一段高水平表達(dá)后，再次下降的趨勢(shì)，說(shuō)明NPY跟大菱鲆的攝食相關(guān)，并且饑餓只能暫時(shí)提高NPY的表達(dá)量；在再投喂實(shí)驗(yàn)中，饑餓后再投喂會(huì)使NPY的表達(dá)量升高，并且饑餓時(shí)間越長(zhǎng)，再投喂后NPY的表達(dá)水平越高，但是再投喂2 h后表達(dá)量還會(huì)再次下降至相似的水平，這都預(yù)示著NPY對(duì)攝食的調(diào)控可能是一種短期的調(diào)控機(jī)制。大菱鲆饑餓12 h后，NPY基因的表達(dá)水平開(kāi)始顯著上升；而金魚(yú)饑餓72 h后，NPY基因的表達(dá)量才開(kāi)始顯著升高；鯰魚(yú)則需要至少三周的時(shí)間，NPY基因的表達(dá)水平才會(huì)出現(xiàn)變化[16，21]，這說(shuō)明可能不同魚(yú)類的耐饑餓程度及NPY的對(duì)攝食調(diào)節(jié)的強(qiáng)度不同。攝食0 h后和攝食2 h后的NPY的表達(dá)量會(huì)發(fā)生顯著變化，這說(shuō)明可能NPY不參與攝食后的消化過(guò)程，只是起到了刺激食欲的作用。NPY基因?qū)︷囸I的生理效應(yīng)與其他攝食刺激因子相一致，如Orexin[30]、AgRP[31]和ghrelin[32]，與其他攝食抑制因子的生理效應(yīng)相反，例如 CART[24，33]和 POMC[34，35]。

這些結(jié)果表明，NPY參與大菱鲆的攝食調(diào)控，并且可能起到促進(jìn)攝食的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

本文首次克隆了大菱鲆的NPY基因并對(duì)其結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征進(jìn)行了初步研究。大菱鲆NPY基因在神經(jīng)組織中的表達(dá)水平較高，并且在下丘腦中有最大表達(dá)量，這與其他脊椎動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，但NPY在不同物種的外周組織中的表達(dá)量有所變化。在饑餓和再投喂實(shí)驗(yàn)中，初步得出大菱鲆NPY是一種促進(jìn)攝食的食欲刺激因子，與其他物種的研究結(jié)果相一致。但是，NPY促進(jìn)攝食的相關(guān)分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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