甘玲玲，王蔚芳，高淳仁，雷霽霖

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071；2.四川省富順縣水產(chǎn)漁政局，四川富順643200）

1 前言

隨著鲆鰈類養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，疾病問題日顯突出，其中細(xì)菌性疾病占到鲆鰈類病害發(fā)生率的50%以上，包括各種弧菌，如鰻弧菌(Vibrio anguillarum)[1，2]、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)[3]、哈維弧菌(Vibrio harveyi)[4]、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)[5]；引起癤瘡病的殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)[6]、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)[7]等；引起腹水病的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[8]、遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)[9]等。

抗血清是指動(dòng)物經(jīng)抗原物質(zhì)刺激后所產(chǎn)生的含有相應(yīng)抗體的血清，包括抗毒素、抗細(xì)菌、抗病毒血清[10]?？寡逶谘芯恐锌捎米鳂?biāo)準(zhǔn)陽性血清，在臨床應(yīng)用中則可作為一種良好的治療性抗體。如傷寒菌的抗血清可用于傷寒病的診斷，甲胎蛋白的抗血清可診斷原發(fā)性肝癌，抗豬瘟血清能有效地控制豬瘟的疫情，羊抗犬瘟熱異源單血清對(duì)犬瘟熱有獨(dú)特的療效[10～12]。相對(duì)于人、畜牧類的抗血清研究，魚類的抗血清研究應(yīng)用幾乎未見報(bào)道。本文用8種鲆鰈類常見病原菌制備滅活疫苗免疫大菱鲆獲得抗血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定各抗血清的效價(jià)，并對(duì)8種病原菌、遲緩愛德華菌蛋白與各菌抗血清之間的免疫交叉反應(yīng)進(jìn)行分析，基于此結(jié)果初步判斷所得抗血清的質(zhì)量，為進(jìn)一步探索鲆鰈類細(xì)菌性疾病的預(yù)防、診斷及治療奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)魚及飼養(yǎng)條件

試驗(yàn)用健康大菱鲆購自青島通用水產(chǎn)有限公司，體重500 g，水溫15℃，暫養(yǎng)一周后發(fā)現(xiàn)無任何異常情況即開始進(jìn)行試驗(yàn)，免疫接種前后按常規(guī)養(yǎng)殖程序管理。

2.2 菌株來源及接種培養(yǎng)

試驗(yàn)用菌株來自中國海洋大學(xué)生命學(xué)院，共8株，分別為鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、鮰愛德華菌和遲緩愛德華菌。取弧菌接種于2216E平板28℃培養(yǎng)24 h，鮰愛德華菌接種于腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)中20℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，其他非弧菌接種于Luria-Bertani（LB）平板28℃培養(yǎng)24 h。然后將弧菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯28℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，鮰愛德華菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中20℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，其他非弧菌接種于LB液體培養(yǎng)基中28℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h(遲緩24 h)。

2.3 滅活疫苗的制備

將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入離心管中，4 000 r/m in，20min后，棄上清，收集菌體。用0.85%無菌生理鹽水重懸菌體，按表1進(jìn)行細(xì)菌滅活[13～20]。用無菌生理鹽水洗脫甲醛，4 ℃，4 000 r/m in，20m in，反復(fù)兩次，后重懸于無菌生理鹽水，并調(diào)整濃度為109cfu/m L，以平板培養(yǎng)法檢測滅活效果。將弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑分別與滅活各菌液等體積混勻，使用超聲波破碎儀進(jìn)行乳化。制備好的疫苗4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 菌滅活條件Table1 The conditions of bacterial inactivation

2.4 大菱鲆的免疫與采血

試驗(yàn)用魚隨機(jī)分為9組，每種疫苗接種三尾，對(duì)照組注射等量無菌生理鹽水，免疫程序見表2。分別于免疫前及免疫后第2周、第4周、第6周、第8周、第10周、第12周對(duì)免疫魚進(jìn)行尾靜脈采血，分離血清，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 免疫程序Table2 The immunization schedule

2.5 菌蛋白來源

試驗(yàn)用遲緩愛德華菌蛋白來自華東理工大學(xué)，是一種遲緩愛德華菌免疫保護(hù)性抗原，為遲緩愛德華菌鞭毛相關(guān)蛋白，專利號(hào)：201110095826.7[21]。

2.6 ELISA

1）包被：用磷酸緩沖液將各滅活菌液(107cfu/m L)及遲緩愛德華菌蛋白(2μg/m L)包被于酶標(biāo)板，每孔50μL，置4℃過夜。

2）封閉：磷酸鹽-吐溫溶液洗滌，將酶標(biāo)板扣干，加入5%脫脂牛奶，每孔200μL，37℃恒溫封閉1 h。

3）與抗血清的反應(yīng)：同上洗滌后，加入從1:100開始二倍系列稀釋(磷酸鹽作稀釋液)的各抗血清，每孔50μL，37℃恒溫孵育30m in。

4）與單抗及酶標(biāo)二抗的反應(yīng)：同樣洗滌后，加入用5%脫脂牛奶稀釋的鼠抗大菱鲆免疫球蛋白單克隆抗體腹水(本實(shí)驗(yàn)室制備并保存)1:25 000稀釋液，每孔50μL，37℃恒溫孵育30m in；同上洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠抗體(5%脫脂牛奶1:2 000稀釋，50μL)，37℃恒溫孵育30m in。

5）顯色及終止：洗滌后每孔加入可溶性單組分四甲基聯(lián)苯胺底物溶液50μL并顯色10min，然后每孔加終止液(2M H2SO4)50μL，最后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的optical density(OD)值(5m in內(nèi)讀數(shù)，P/N≥2.1時(shí)判定為陽性，其中P為實(shí)驗(yàn)孔讀值，N為對(duì)照孔讀值)。

3 結(jié)果

3.1 遲緩愛德華菌抗血清效價(jià)變化

遲緩愛德華菌滅活疫苗免疫大菱鲆后第4周開始產(chǎn)生特異性抗體，抗體效價(jià)為1:3 200；之后抗體水平逐步升高；第10周抗體水平升高到1:102 400，并維持這一水平至第12周(見表3)。

表3 間接ELISA法測定遲緩愛德華菌滅活疫苗免疫大菱鲆后血清抗體效價(jià)的變化Table3 Antibody titer of turbot serum vaccinated with Edward siella tarda by indirect ELISA

3.2 各病原菌抗血清效價(jià)

免疫后第10周各病原菌抗血清效價(jià)見表4。

表4 8種病原菌抗血清效價(jià)Table4 The titer of anti-serum against eight bacterium

3.3 病原菌及菌蛋白與各抗血清的免疫交叉反應(yīng)

3.3.1 病原菌

運(yùn)用ELISA法，對(duì)8種病原菌與8種病原菌抗血清的免疫交叉反應(yīng)進(jìn)行了分析。由圖1可以看出，各病原菌抗血清與其對(duì)應(yīng)的病原菌反應(yīng)最強(qiáng)烈；鰻弧菌抗血清與鮰愛德華菌反應(yīng)較強(qiáng)，與創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌反應(yīng)較弱；創(chuàng)傷弧菌抗血清與其他7種菌的反應(yīng)相對(duì)較強(qiáng)；哈維弧菌抗血清與其他菌反應(yīng)都比較弱；溶藻弧菌抗血清與創(chuàng)傷弧菌、豚鼠氣單胞菌的反應(yīng)相對(duì)較強(qiáng)，與鰻弧菌、哈維弧菌、嗜水氣單胞菌、鮰愛德華菌、遲緩愛德華菌的反應(yīng)較弱；豚鼠氣單胞菌抗血清與鰻弧菌、遲緩愛德華菌的反應(yīng)較強(qiáng)，與創(chuàng)傷弧菌、哈維弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、鮰愛德華菌的反應(yīng)較弱；嗜水氣單胞菌抗血清與其他7種菌的反應(yīng)較弱；鮰愛德華菌與其他7種菌的反應(yīng)較強(qiáng)；遲緩愛德華菌抗血清與其他7種菌的反應(yīng)較弱。

圖1 ELISA檢測8種病原菌抗血清與8種病原菌的交叉反應(yīng)Fig.1 The sesult of eight anti-serum react with eight bacterium

3.2.2 遲緩愛德華菌蛋白

運(yùn)用ELISA法，檢測遲緩愛德華菌蛋白與各細(xì)菌抗血清的免疫交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示，僅遲緩愛德華菌抗血清的效價(jià)高，并且效價(jià)水平與用遲緩愛德華菌檢測結(jié)果一致，而其他7種菌的抗血清效價(jià)均下降(見圖 2)。

圖2 ELISA法檢測8種病原菌抗血清與遲緩愛德華菌蛋白的免疫反應(yīng)Fig.2 The result of Edward siella tarda protein reactwith eight kinds of anti-serum

4 結(jié)語

本試驗(yàn)利用福爾馬林滅活病原菌制備滅活疫苗，肌肉注射大菱鲆獲得抗血清，并運(yùn)用ELISA方法檢測各菌抗血清的效價(jià)在1:6 400～1:102 400。本研究表明，各菌抗血清具有較高效價(jià)，但其效價(jià)不同可能是由于大菱鲆對(duì)各菌的敏感性不同或抗血清中含有的雜蛋白質(zhì)等因素造成的，也與各種病原菌本身構(gòu)成的復(fù)雜性相關(guān)。

運(yùn)用ELISA檢測方法對(duì)8種病原菌與抗血清進(jìn)行了免疫反應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)8種菌與各自對(duì)應(yīng)的抗血清間的免疫反應(yīng)最為強(qiáng)烈，但與其他細(xì)菌的抗血清亦有微弱的交叉反應(yīng)；而在應(yīng)用遲緩愛德華菌菌蛋白與各抗血清的免疫反應(yīng)進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅遲緩愛德華菌的抗血清效價(jià)高，其他菌的抗血清效價(jià)均大幅下降。本結(jié)果表明，各菌抗血清具有特異性，可用于鲆鰈類病原菌及遲緩愛德華菌蛋白的檢測，但各病原菌與其他病原菌抗血清之間不同程度的交叉反應(yīng)為抗血清的應(yīng)用帶來一定的影響。

特異性抗血清在臨床應(yīng)用中可用作治療性抗體，廣泛應(yīng)用于疫病流行早期對(duì)未感染動(dòng)物的短期預(yù)防及疫病的早期治療；在研究中還可用作標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用于微生物鑒定及疾病診斷。但是，抗血清的研究和應(yīng)用中存在以下問題需要解決。

1）抗血清的安全性。新制備的抗血清必須保證沒有外源病原，而抗血清中的外源病原如何清除是一個(gè)難題。一般情況下，抗血清中的外源病原主要是病毒，清除病毒一般需要進(jìn)行病毒排除、病毒去除及病毒滅活三個(gè)方面的程序，而有效的病毒處理技術(shù)還需進(jìn)一步發(fā)展。

2）抗血清的效價(jià)。影響抗血清效價(jià)的因素主要包括抗原、動(dòng)物的選擇、免疫劑量、次數(shù)、間隔時(shí)間、血清處理以及保存血清的溫度、期限等。因此如何獲得高效價(jià)特異性抗血清以及如何避免抗血清效價(jià)降低是以后的一個(gè)研究方向。

鲆鰈類雖然在我國養(yǎng)殖時(shí)間較短，但已成為我國海水養(yǎng)殖魚類的重要組成部分。鲆鰈類養(yǎng)殖以高密度的工廠化養(yǎng)殖模式為主，其疾病問題日益加劇，相關(guān)研究也越來越多。本試驗(yàn)制備了鲆鰈類常見病原菌的抗血清并將其應(yīng)用于檢測病原菌及菌蛋白。但抗血清存在著安全性、效價(jià)降低、質(zhì)量等問題，對(duì)其研究及應(yīng)用帶來了困擾，目前，還沒有有效的方法解決這些問題。在今后的研究中可在如何清除抗血清中外源病原、血清處理及保存方法、提高抗血清質(zhì)量等方面進(jìn)行深入研究。

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