陳博雯 ，蓋 穎 ，蔣湘寧

（1.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 廣西林科院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002）

尾葉桉GLU4肉桂酰-輔酶A還原酶基因克隆及原核表達(dá)

陳博雯1，2，蓋 穎1，蔣湘寧1

（1.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 廣西林科院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002）

肉桂酰-輔酶A還原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase，CCR)是木質(zhì)素合成中的關(guān)鍵酶，根據(jù)植物中CCR保守序列設(shè)計(jì)引物，以尾葉桉GLU4嫩莖為材料克隆到其CCR基因，命名為EuCCR。該基因gDNA長(zhǎng)2 918 bp，cDNA長(zhǎng)1 045 bp，CDS區(qū)編碼336個(gè)氨基酸。EuCCR核酸序列與GenBank已登錄的桉屬植物CCR基因同源性達(dá)到96%以上，與傘房屬、杯果木屬植物CCR的同源性達(dá)85%以上，其編碼的氨基酸序列經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)具有完整FR_SDR_e結(jié)構(gòu)域及NADP結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)，與可可樹(shù)等植物中CCR基因編碼序列同源性也在84%以上，確定為CCR基因。對(duì)EuCCR蛋白序列理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用MEGA軟件對(duì)基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。采用pQE30/M15系統(tǒng)對(duì)EuCCR進(jìn)行原核表達(dá)，重組質(zhì)粒成功表達(dá)分子量約36 kD的目的蛋白。本研究從尾葉桉GLU4中克隆得到EuCCR基因并原核表達(dá)，為該基因的酶學(xué)分析以及利用該基因轉(zhuǎn)化調(diào)控尾葉桉木質(zhì)素合成奠定基礎(chǔ)。

尾葉桉；肉桂酰-輔酶A還原酶；生物信息學(xué)分析；原核表達(dá)

桉樹(shù)是桃金娘科桉屬植物的總稱，原產(chǎn)地為澳大利亞，桉樹(shù)品種多、生長(zhǎng)快，其木材工業(yè)特性好，堅(jiān)韌耐腐，是最常用的制造紙漿的主要原料[1-2]。在我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)多個(gè)省份都種植有桉樹(shù)人工林[3-8]。廣西的桉樹(shù)研究在我國(guó)處于領(lǐng)先地位。20世紀(jì)70年代初期就開(kāi)始引種，經(jīng)過(guò)多年的引種試驗(yàn)及雜交選育，得到了多個(gè)優(yōu)良樹(shù)種、優(yōu)良種源及優(yōu)良家系[2]，截止2010年，全區(qū)桉樹(shù)面積達(dá)2 480萬(wàn)畝，占全區(qū)人工商品林面積的30.5%，居全國(guó)第1位，桉樹(shù)已經(jīng)成為短周期原料林的主要造林樹(shù)種，在造紙木漿生產(chǎn)中有著極重要的地位。

木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁中的一類(lèi)苯丙烷類(lèi)衍生物，去除木質(zhì)素是制漿工藝中的重要步驟，直接關(guān)系到整個(gè)制漿生產(chǎn)的污染情況和成本高低。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，從而降低植物木質(zhì)素含量，從根本上減少制漿中都污染成本，是目前的研究熱點(diǎn)。肉桂酰-輔酶A還原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase，CCR)催化木質(zhì)素單體的生物合成中第一個(gè)特定步驟，它將相應(yīng)的化合物的CoA 形式轉(zhuǎn)化為醛的形式。是幾種木質(zhì)素單體合成途徑中的共有酶，對(duì)木質(zhì)素的合成起重要作用[9]，是調(diào)控木質(zhì)素合成的首選基因。

尾葉桉GLU4無(wú)性系(Eucalyptus urophyllaclone GLU4)是廣西審定的桉樹(shù)良種，材性適宜造紙，在廣西種植范圍廣，以此樹(shù)種作為轉(zhuǎn)基因育種材料，具有良好的應(yīng)用前景。本研究以尾葉桉GLU4無(wú)性系為材料，克隆得到EuCCR基因，并對(duì)其序列進(jìn)行生物學(xué)分析， 而后對(duì)EuCCR基因進(jìn)行原核表達(dá)分析，為該基因的酶學(xué)分析以及更進(jìn)一步利用該基因轉(zhuǎn)化調(diào)控尾葉桉木質(zhì)素合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為尾葉桉GLU4無(wú)性系Eucalyptus urophyllaclone GLU4，取自廣西林科院生物工程與技術(shù)研究所苗圃。

DNA secure新型植物基因組DNA提取試劑盒、RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA純化、凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。RNA LA PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq DNA 聚合酶、克隆載體pMD-18T購(gòu)自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自 Promega公司，IPTG、X-Gal、Ampicillin、kanamycin購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。E.coliDH5α、M15菌株及表達(dá)載體PQE30為本實(shí)驗(yàn)室保存。基因擴(kuò)增引物由北京華大基因生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 EuCCR序列PCR擴(kuò)增

取移栽培養(yǎng)3～4周的GLU4組培苗莖部組織，分別按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取基因組DNA和總RNA，并取總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法合成cDNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在NCBI檢索其他植物中已報(bào)道的CCR基因序列，blast分析保守區(qū)用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)引物：

Sense primer CCR-F1: CAATCCCACCATGCC CGTCG

Anti-sense primer CCR-R1: GTGCGCGCCATG ATGGATCTAAGATC

分別以gDNA和cDNA作為模板，擴(kuò)增目的基因的gDNA片段及cDNA片段。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min（cDNA擴(kuò)增延伸時(shí)間1 min），28個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃保存30 min。

1.3 克隆載體構(gòu)建

gDNA及cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下目的條帶凝膠回收后與pMD-18T載體16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，隨機(jī)挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆用CCR-F1/CCR-R1引物PCR驗(yàn)證后，由華大基因生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

1.4 序列生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI搜索引擎中的Blastn在線工具進(jìn)行同源性分析；利用NCBI的ORF Finder尋找閱讀框，完成DNA序列的翻譯,并用Blastp分析蛋白序列同源性及保守區(qū)域、活性位點(diǎn)；利用Vector NTI中的AliginX軟件將gDNA和cDNA序列測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析外顯子和內(nèi)含子；運(yùn)用Expasy網(wǎng)站的ProtParam完成蛋白序列的氨基酸組成、等電點(diǎn)及親疏水性分析；應(yīng)用丹麥科技大學(xué)(DTU)提供的TMHMM和SignalP工具分析序列中的跨膜區(qū)和信號(hào)肽；利用ExPaSy中的psipred分析序列二級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用SWISS-MODEL軟件對(duì)基因氨基酸序列進(jìn)行同源三級(jí)結(jié)構(gòu)建模并分析；應(yīng)用MEGA 5.0工具的ClustalW分析EuCCR與其他物種中CCR基因序列，并采用Neighbor-Jioning算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)

1.5 表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)克隆到pMD-18T載體上的CCR cDNA序列，采用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)引物（帶有酶切位點(diǎn)）

Sense primer CCR-F2(BamHⅠ): GGGGGA TCCATGCCCGTCGACGCCCTC

Anti-sense primer CCR-R2(HindⅢ):GGGAAGCTTTCATCCCTGAATACGCAC

PCR擴(kuò)增CCR cDNA的CDS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，同時(shí)將PQE30質(zhì)粒BamHⅠ/HindⅢ雙酶切。 37℃酶切4 h后0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收目的基因片段及線性PQE30質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。挑選陽(yáng)性克隆用CCR-F2/CCR-R2引物PCR驗(yàn)證，并用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切驗(yàn)證。

1.6 原核表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)

將驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliM15，Ampicillin、kanamycin雙抗性篩選陽(yáng)性克隆，接種于 10mL 含Ampicillin、kanamycin的 LB 液體培養(yǎng)基，37℃200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基中(含Ampicillin，kanamycin)，振蕩培養(yǎng) 3～5 h 至 OD600為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為 1 mmol/L，同時(shí)設(shè)立不加入IPTG的處理作為對(duì)照。繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 4 h，離心收集菌體，用 1 mL PBS 緩沖溶液懸浮后，超聲波破胞， 離心取8 μL上清液加入2 μL 5×上樣緩沖溶液， 混勻后沸水浴 5 min，離心取5 μL上清SDS-PAGE檢測(cè)。 蛋白條帶用考馬斯亮蘭R250染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLU4中CCR基因克隆

通過(guò)PCR成功的擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度分別為3 000 bp、1 000 bp左右的目的片段（見(jiàn)圖1a），與推測(cè)的CCR基因的gDNA片段以及cDNA片段長(zhǎng)度相符，條帶清晰無(wú)非特異性雜帶。目的片段連接至pMD-18T載體后挑選陽(yáng)性克隆用CCR-F1/CCR-R1引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，分別得到長(zhǎng)度為3 000 bp和1 000 bp左右的片段（見(jiàn)圖1b），說(shuō)明目的片段已經(jīng)成功克隆到pMD-18T載體上，重組質(zhì)粒分別命名為pT-CCR-gDNA和pT-CCR-cDNA，各取3個(gè)克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示克隆得到的CCR gDNA序列長(zhǎng)度2 918 bp，cDNA序列長(zhǎng)度1 045 bp。利用NCBI在線blast分析，序列與岡尼桉(X79566.1)，藍(lán)桉(AB591264.1)，柳葉桉(AF297877.1)，圓果桉(FJ834288.1)中CCR基因一致性分別為98%、99%、98%、96%，與GenBank已登錄的傘房屬、杯果木屬植物的CCR基因一致性也達(dá)到90%(DQ309047.2)，89%(EF612728.1)，85%(DQ309061.1)，且序列中包含有完整CDS，初步說(shuō)明克隆所得片段為的CCR基因，命名為EuCCR。

圖1 EuCCR基因的克隆Fig.1 Cloning of EuCCR gene

利用NCBI的ORF Finder將EuCCR基因編碼區(qū)翻譯氨基酸序列，編碼336個(gè)氨基酸，應(yīng)用NCBI的blastp比對(duì)分析氨基酸序列，結(jié)果顯示序列中包含完整的FR_SDR_e保守結(jié)構(gòu)域以及NADP結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖2b)，F(xiàn)R_SDR_e屬于是NADP依賴還原酶家族蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域，在植物黃酮類(lèi)等次級(jí)代謝途徑中的異構(gòu)酶、還原酶和裂解酶中都含有此結(jié)構(gòu)域，與CCR酶學(xué)功能相符。氨基酸序列比對(duì)表明，EuCCR編碼序列與藍(lán)桉(AAT74879.1)、柳葉桉(AAG16242.1)、岡尼桉(CAA56103.1)CCR基因編碼序列一致性為99%，與異心葉桉(AAT74875.1)、圓果桉(ACZ59063.1)、可可樹(shù)(EOY26038.1)、橡膠樹(shù)(ADU64758.1)、碧桃(EMJ16703.1)、毛白楊(ACE95172.1)、毛果楊(CAC07424.1)中CCR基因編碼序列一致性分別為98%、96%、85%、85%、84%、84%，進(jìn)一步證實(shí)克隆到的基因序列確實(shí)為CCR基因。

圖2 EuCCR序列分析Fig.2 Analysis of EuCCR sequence

使用Vector NTI中的AliginX軟件將EuCCR的gDNA和cDNA序列比對(duì)，顯示基因含有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子(見(jiàn)圖2a)，其中第4個(gè)外顯子和第4個(gè)內(nèi)含子為基因中最長(zhǎng)的外顯子和內(nèi)含子，這與Poke文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

2.2 EuCCR序列分析

2.2.1 理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ExPaSy中的Protparam工具分析EuCCR編碼蛋白序列，結(jié)果表明該蛋白由336個(gè)氨基酸殘基組成，分子式為C1624H2592N434O489S13；相對(duì)分子量為36.44 kD；理論pI值為5.87，為酸性蛋白；總平均親水性為-0.078，不穩(wěn)定系數(shù)為30.95，小于40，推斷蛋白質(zhì)為穩(wěn)定性蛋白；從氨基酸組成分析，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)共41個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+ Lys)共36個(gè)；綜合分析表明該蛋白質(zhì)是一個(gè)帶負(fù)電荷的酸性蛋白質(zhì)。

應(yīng)用丹麥科技大學(xué)(DTU)提供的TMHMM在線分析跨膜區(qū)，未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP在線分析結(jié)果顯示，EuCCR編碼蛋白不包含信號(hào)肽序列，說(shuō)明該蛋白不屬于膜蛋白或分泌蛋白，應(yīng)該是定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，這與該基因的功能定位相符。

利用ExPaSy中的psipred分析序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示該蛋白具有11個(gè)α-螺旋和11個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖3a），運(yùn)用SWISS-MODEL對(duì)EuCCR進(jìn)行同源三級(jí)結(jié)構(gòu)建模。構(gòu)建范圍從第10個(gè)氨基酸到第326個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖3b），其建模參考模板為葡萄的二氫黃酮醇-4-還原酶蛋白，該蛋白也屬于NADP依賴還原酶家族[11]。目標(biāo)蛋白與參考蛋白的序列比對(duì)同源性為76.28%；模型評(píng)估E值為0.00e-1，說(shuō)明此次同源建?？煽啃詷O高，推測(cè)EuCCR具有NADP依賴的還原酶功能，這與CCR的酶學(xué)功能符合。

2.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索已登錄的CCR蛋白質(zhì)序列，共檢索到920條植物CCR蛋白序列，選擇各科屬植物中的26條序列與EuCCR進(jìn)行序列比對(duì)分析。應(yīng)用MEGA 5.0工具的ClustalW分析EuCCR與其他物種CCR編碼蛋白序列同源性，并采用Neighbor-Jioning算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖4）。

系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，EuCCR與藍(lán)桉、圓果桉、柳葉桉等桉屬植物中CCR聚為一類(lèi)，之后與杯果木屬、傘房屬植物CCR聚為一類(lèi)，進(jìn)化分析結(jié)果與分類(lèi)學(xué)相一致。EuCCR與楊屬、松屬CCR親緣性較遠(yuǎn)，但同源性也達(dá)到83%和78%，說(shuō)明CCR在各物種的進(jìn)化中仍是較為保守的基因，這可能與CCR基因在植物生長(zhǎng)中的組成型功能有關(guān)。

2.3 EuCCR原核表達(dá)

采 用 引 物 CCR-F2/CCR-R2， 以pT-CCR-cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增EuCCR的完整CDS序列，雙酶切連接pQE30構(gòu)建重組表達(dá)載體，采用CCR-F2/CCR-R2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖5a，3個(gè)陽(yáng)性克隆均擴(kuò)增得到1 045 bp長(zhǎng)度的片段。將PCR驗(yàn)證的3個(gè)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖5b， 3個(gè)陽(yáng)性克隆均酶切得到了3 600 bp左右的載體片段和1 045 bp的插入外源片段，說(shuō)明EuCCR原核表達(dá)重組載體構(gòu)建成功，命名為pQE30-EuCCR。

圖3 EuCCR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Protein structure analysis of EuCCR

圖4 EuCCR系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of EuCCR

圖5 pQE30-EuCCR構(gòu)建Fig.5 Vector construction of pQE30-EuCCR

將pQE30-EuCCR轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主M15中IPTG誘導(dǎo)原核表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果如圖6。根據(jù)EuCCR氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為36.44 kD，誘導(dǎo)表達(dá)后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株中出現(xiàn)大小約36 kD 的蛋白條帶，與預(yù)期相吻合，未加IPTG的對(duì)照則沒(méi)有相應(yīng)的條帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒經(jīng) 1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo) 3 h 后成功表達(dá)目的蛋白。

圖6 EuCCR基因原核表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果Fig.6 Prokaryotic expression SDS-PAGE of EuCCR

3 結(jié)論與討論

CCR是木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是潛在的碳向木質(zhì)素分配的控制關(guān)節(jié)點(diǎn)，是調(diào)控植物木質(zhì)素合成的理想靶標(biāo)[12]。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)負(fù)調(diào)節(jié)煙草中CCR，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素含量明顯降低同時(shí)一些非正常的酚類(lèi)物質(zhì)增加[13-14]。部分反義轉(zhuǎn)化CCR的轉(zhuǎn)基因植株中，S 與G 木質(zhì)素含量均降低的同時(shí)，伴隨生長(zhǎng)停滯，葉型卷縮，花期延長(zhǎng)，導(dǎo)管變形，木質(zhì)部有顏色變化等異常表型，但將CCR 和CAD 負(fù)調(diào)節(jié)的單轉(zhuǎn)基因植物雜交，可以得到木質(zhì)素含量降低且表型正常的后代，說(shuō)明兩個(gè)基因可能協(xié)同作用降低木質(zhì)素含量[15]，也說(shuō)明木質(zhì)素含量明顯降低的植物至少在自然條件下可以進(jìn)行正常的發(fā)育。

Poke等[10]對(duì)23個(gè)桉樹(shù)樹(shù)種的CCR基因遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，測(cè)序得到大約44%的CCR基因，序列只限于內(nèi)含子 4和部分外顯子 4和5，并未得到CCR的完整CDS。根據(jù)Poke等提交的序列分析，其部分外顯子序列與本研究中得到EuCCR具有很高的一致性，更進(jìn)一步確定了EuCCR的可靠性。

本研究利用RT-PCR技術(shù)從尾葉桉GLU4幼苗莖部組織中克隆到肉桂酰輔酶A還原酶基因，利用多種生物信息學(xué)工具通過(guò)同源比對(duì)、保守序列及功能位點(diǎn)分析、同源建模、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建等方法對(duì)EuCCR進(jìn)行序列分析，確定其為尾葉桉GLU4無(wú)性系中的CCR基因，為下一步構(gòu)建反義或RNAI載體轉(zhuǎn)化植株奠定基礎(chǔ)。在本研究中，通過(guò)亞克隆構(gòu)建原核表達(dá)載體對(duì)EuCCR進(jìn)行原核表達(dá)，得到分子量與預(yù)期一致的CCR蛋白，也為下一步EuCCR的酶學(xué)活性分析提供了材料。

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Cloning and prokaryotic expression of cinnamoyl Co-A reductase ofEucalyptus urophyllaclone GLU4

CHEN Bo-wen1,2, GAI Ying1, JIANG Xiang-ning1
(1. School of Biology Science and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Guangxi Key Lab. of Superior Timber Trees Resource Cultivation, Guangxi Forestry Research Institute, Nanning 530002, Guangxi, China)

Cinnamoyl Co-A reductase is a key enzyme in lignin synthesis pathway. A CCR gene was cloned from the immature stem ofEucalyptus urophyllaclone GLU4 and namedEuCCRby using specif i c primers based on the highly conserved sequences of plant CCR. The gDNA and cDNA sequence ofEuCCRwere 2918 bp and 1045 bp respectively, which CDS encodes 336 amino acid residues.EuCCRhad more than 96% sequence homology withEucalyptusthat had been logged in GenBank, and its homology withAngophoraandCorymbiawere over 85%.EuCCRencoding sequence was analyzed, the result shows it has an entire FR_SDR_e domain, a NADP binding site and a substrate binding site. The homology with Theobroma cacao and others were over 84%. The physicochemical property, structure of EuCCR and its phylogenetic analysis were analyzed by using bioinformatics tools and MEGA. The SDS-PAGE analysis showed thatEuCCRwas transformed into pQE30/M15 system and fusion protein with molecular weighting about 39 kD was successfully expressed in transformant. The cloning and expression ofEuCCRgene provided some effective resources for enzymology research and further transgenic research.

Eucalyptus urophylla; Cinnamoyl Co-A reductase; bioinformatics analysis; prokaryotic expression

S792.39

A

1673-923X(2014)11-0071-06

2014-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400522）；廣西林業(yè)科技項(xiàng)目（桂林科字[2014]第33號(hào)）；廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題基金項(xiàng)目（12A0302）

陳博雯（1983-），女，博士研究生，主要從事植物生物技術(shù)方面的研究；E-mail：grf i_bwchen@163.com

蔣湘寧（1958-），男，教授，主要從事植物分子生物學(xué)方面的研究；E-mail:xiangning_jiang@163.com

[本文編校：吳 毅]