摘要：骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變病變慢性疾病，近些年發(fā)病率在不斷增高?；A(chǔ)研究主要有各種原因引起的細(xì)胞數(shù)量過(guò)少而無(wú)法開(kāi)展下去。在建立動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上更有效的提取軟骨細(xì)胞、體外培養(yǎng)對(duì)基礎(chǔ)研究做出最基本鋪墊，為臨床治療提供更有效的理論依據(jù)。本文通過(guò)軟骨的提取、軟骨的消化、細(xì)胞的收集、培養(yǎng)、鑒定，結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)做一綜述。

關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；體外培養(yǎng)

軟骨組織﹙cartilage）由軟骨細(xì)胞﹙chondrocyte）和細(xì)胞外基質(zhì)﹙extracellularmatrix， ECM﹚構(gòu)成，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨主要構(gòu)成成分，主要功能是合成、分泌軟骨基質(zhì)，維持軟骨組織新陳代謝，是軟骨破壞過(guò)程中的靶細(xì)胞，因此軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究關(guān)節(jié)軟骨生理及病理的常用體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，尤其是骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的提取在研究治療骨關(guān)節(jié)炎、最基本最關(guān)鍵的一步[1]。自從1967年Manning[2]采用胰蛋白酶和細(xì)菌膠原酶聯(lián)合消化法獲得了高純度的軟骨細(xì)胞以來(lái)，為了獲得數(shù)量較多的軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的提取、培養(yǎng)、傳代、鑒定，等不斷改進(jìn)。但不同的動(dòng)物，不同的模型對(duì)軟骨細(xì)胞的提取也有一定的不同。本文通過(guò)對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎造模成功后提取軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、傳代、鑒定進(jìn)一步認(rèn)識(shí)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的要點(diǎn)及關(guān)鍵問(wèn)題等。

1軟骨的提取

將實(shí)驗(yàn)兔用空氣栓塞法處死，沿右膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)皮膚直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心約6 cm×6 cm的區(qū)域，浸泡于75%的酒精中20～30 min，放入超凈臺(tái)中打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔，無(wú)菌條件下用11號(hào)刀片（帶柄）削取膝關(guān)節(jié)股骨髁和脛骨平臺(tái)軟骨組織，將獲得關(guān)節(jié)軟骨組織，置入盛有含青霉素鈉/鏈霉素雙抗液 （1×1010U/L）的D-hanks液的無(wú)菌平皿中，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍，用眼科剪將軟骨組織剪成1mm3小塊，見(jiàn)圖1，然后再用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍。

在軟骨的提取過(guò)程中首先必須在無(wú)菌的條件下打開(kāi)關(guān)節(jié)削取軟骨，我們總會(huì)最大量的削取更多的軟骨使得提取更多軟骨細(xì)胞，但更要主要的是①避免削取軟骨以外的組織，避免細(xì)胞提取還有其他組織細(xì)胞；②削取軟骨時(shí)不要削的太厚，可以一層層的削，這樣可以有助于軟骨的消化；③削取完后軟骨組織必須剪成1 m3小塊，有助于軟骨的消化，用緩沖液多清洗幾遍更好地去除血液、脂肪組織等其他組織。

2軟骨的消化

用0.25%胰蛋白酶先消化30～35 min，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍；加入0.2%Ⅱ型膠原酶（DMEM配制），置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)消化100 min，每30 min置37℃恒溫振蕩箱振蕩5 min。后抽取上清液用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾入離心管，800 r/min離心4min棄上清，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗兩遍每次800 r/min離心4min棄上清去除膠原酶。加入含12%胎牛血清DMEM 3 mL。用槍輕輕吹打可獲得單個(gè)軟骨細(xì)胞懸液。將軟骨細(xì)胞按1×105/L濃度接種于10 mL培養(yǎng)皿中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿中剩余的軟骨加入1%Ⅱ型膠原酶（DMEM配制） 置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)消化，每1 h置37℃恒溫振蕩箱振蕩5 min。倒置顯微鏡下觀察，軟骨細(xì)胞大部分分離后，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾入離心管，800 r/min離心4 min棄上清，用含雙抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗2遍800 r/min/次，離心4 min棄上清去除膠原酶。加入含12%胎牛血清DMEM 3 mL。用槍輕輕吹打可獲得單個(gè)軟骨細(xì)胞懸液。將軟骨細(xì)胞按1×105/L濃度接種于10 mL培養(yǎng)皿中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁達(dá)到85%～90%后傳代。

很多文獻(xiàn)中軟骨細(xì)胞消化都在3～6 h，然而軟骨細(xì)胞的消化時(shí)間要大大縮短，這也是兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的一個(gè)弊端，因?yàn)橥米拥能浌羌?xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)越長(zhǎng)細(xì)胞損傷越厲害，雖然有時(shí)我們?cè)诩?xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)看到的都是活細(xì)胞，但放到培養(yǎng)瓶里樣上兩天基本上沒(méi)有貼壁的，軟骨細(xì)胞也是一種群居生活的物種，貼壁細(xì)胞越少增值能力越低。

3細(xì)胞的傳代及培養(yǎng)

軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法很多，包括單層培養(yǎng)法、三維培養(yǎng)法、離心管培養(yǎng)法、生物反應(yīng)器等。其中單層培養(yǎng)法、三維培養(yǎng)法用的比較多，因三維培養(yǎng)法需要付出昂貴的費(fèi)用本實(shí)驗(yàn)采用單層培養(yǎng)法來(lái)培養(yǎng)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)后，隨傳代次數(shù)增加，軟骨細(xì)胞發(fā)生去分化現(xiàn)象，限制了軟骨細(xì)胞的大量擴(kuò)增。其中應(yīng)該注意的是提取軟骨細(xì)胞時(shí)應(yīng)用含12%～13%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從第二代細(xì)胞開(kāi)始改用含10%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換液1次，細(xì)胞融合并覆蓋瓶底>80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶﹙含0.02%EDTA﹚消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。主要是因?yàn)殚_(kāi)始時(shí)用含12%～13%FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)是因?yàn)榭梢允辜?xì)胞更容易貼壁，而后改為含10% FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)是為了防止細(xì)胞早期就會(huì)出現(xiàn)\"去分化\"現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)一般選用第三第四代細(xì)胞，其活性與增值能力最強(qiáng)。

細(xì)胞傳代時(shí)應(yīng)注意的是胰蛋白酶消化時(shí)間不要過(guò)程，室溫一般30～60 s或用0.1%的胰蛋白酶。盡可能的減少細(xì)胞的損失。細(xì)胞離心600轉(zhuǎn)5 min，用槍吹打細(xì)胞時(shí)用力不要過(guò)猛。傳代后細(xì)胞損傷嚴(yán)重時(shí)主要表現(xiàn)是細(xì)胞增值能力下降或出現(xiàn)\"去分化\"現(xiàn)象，細(xì)胞的\"去分化\"現(xiàn)象主要表現(xiàn)在細(xì)胞的形態(tài)與分泌，細(xì)胞從多呈三角形、長(zhǎng)梭形或多角形向圓形改變，分泌的Ⅱ型膠原以及蛋白多糖減少。

5細(xì)胞的鑒定

5.1軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察，剛接種的軟骨細(xì)胞呈球形，24～48 h后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞多呈三角形、長(zhǎng)梭形或多角形，72 h后細(xì)胞開(kāi)始增殖，單層生長(zhǎng)，彼此不相接觸。細(xì)胞增長(zhǎng)至爬滿瓶底時(shí)軟骨細(xì)胞可變?yōu)閳A形，胞體豐滿，胞漿均勻，核大而圓并且互相連接成\"鋪路石\"樣結(jié)構(gòu)。蘇木精-伊紅染色蘇木精-伊紅染色可見(jiàn)軟骨細(xì)胞呈三角形或多角形，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，可見(jiàn)明顯的雙核仁或多核仁形態(tài)，細(xì)胞基質(zhì)紅染，胞漿及細(xì)胞周?chē)凶霞t色或紅色異染出現(xiàn)[3]。

5.2Ⅱ型膠原蛋白 Ⅱ型膠原的合成和分泌是軟骨細(xì)胞維持其分化表型的特征性指標(biāo)，可通過(guò)Ⅱ型膠原免疫熒光染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色來(lái)鑒定。Ⅱ型膠原免疫熒光染色﹙異硫氰酸熒光素FITC﹚可見(jiàn)胞漿和胞膜呈清晰綠色熒光，細(xì)胞核區(qū)域未見(jiàn)明顯綠色熒光，證明軟骨細(xì)胞特征性Ⅱ型膠原主要分布在胞漿和細(xì)胞膜上。Ⅱ型膠原免疫組化染色可見(jiàn)軟骨細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，胞核不著色，胞外基質(zhì)中也有棕黃色顆粒出現(xiàn)[4]。

5.3蛋白聚糖蛋 白聚糖是軟骨細(xì)胞分泌的基質(zhì)成分，是軟骨細(xì)胞功能的主要指標(biāo)，可通過(guò)甲苯胺蘭染色和阿利新藍(lán)﹙Alcianblue﹚染色進(jìn)行鑒定。甲苯胺蘭染色可見(jiàn)軟骨細(xì)胞呈紫藍(lán)色，細(xì)胞基質(zhì)呈藍(lán)色，軟骨細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周?chē)兴{(lán)紫色異染顆粒；阿利新藍(lán)染色可見(jiàn)軟骨細(xì)胞胞漿和胞膜呈深藍(lán)色，證明培養(yǎng)軟骨細(xì)胞分泌和合成蛋白聚糖[5]。

5.4 IL-1，TNF-α、MMP-13在細(xì)胞內(nèi)以及分泌表達(dá)在ELRSA試劑盒。

6展望

軟骨是一種特殊類(lèi)型的結(jié)締組織，由軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)和纖維構(gòu)成。軟骨細(xì)胞的功能為合成細(xì)胞外基質(zhì)大分子及各種酶類(lèi)，而軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要有膠原和蛋白多糖聚集體組成。膠原中有間質(zhì)型膠原I、Ⅱ和Ⅲ，且Ⅱ型膠原為軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)產(chǎn)物可用來(lái)確定軟骨細(xì)胞的表型[6]。

1965年Chesterman和Smith首次利用體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞修復(fù)松質(zhì)骨和關(guān)節(jié)軟骨缺損，近30年來(lái)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)在方法學(xué)上也取得了很大進(jìn) 展[7]。軟骨細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)所形成的結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，具有關(guān)節(jié)軟骨的生物學(xué)特征。軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法是從細(xì)胞水平來(lái)探索關(guān)節(jié)軟骨生物學(xué)特性，為研究關(guān)節(jié)軟骨疾病的發(fā)病原理及其治療方法（包括藥物治療）提供了有效而簡(jiǎn)便的方法。以細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，在體外將軟骨細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及凋亡等方面的研究，有助于研究治療某些退行性疾病的藥物，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

因骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞處于退變期，細(xì)胞周期較正常軟骨細(xì)胞周期要短，其可能原因： 骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞為變性軟骨細(xì)胞，細(xì)胞功能的改變可能影響細(xì)胞周期的變化[8]。損傷的骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中，軟骨細(xì)胞代謝活躍，相伴隨的細(xì)胞分泌的各種胞外基質(zhì)也相應(yīng)高表達(dá)，軟骨代謝的異常，導(dǎo)致胞外基質(zhì)成分的異常，軟骨細(xì)胞生存環(huán)境改變促使軟骨細(xì)胞過(guò)早的死亡，加劇骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程；骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中混雜有纖維軟骨細(xì)胞，纖維軟骨細(xì)胞增殖速度明顯較軟骨細(xì)胞快，必將影響細(xì)胞周期的變化[9-10]。

體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞是研究軟骨分化、增殖以及軟骨病變的一種常用模型，也是軟骨組織工程的基礎(chǔ)。目前體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)日漸成熟，可從許多動(dòng)物及人的不同軟骨組織中分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，但是軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法均存在一定的局限性，培養(yǎng)條件還有待進(jìn)一步完善。另外，軟骨細(xì)胞分化、增殖過(guò)程中受到多種調(diào)控因子的調(diào)控，其相互作用機(jī)制復(fù)雜，對(duì)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響還有待進(jìn)一步的深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳百成，張靜.骨關(guān)節(jié)炎[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：175-178.

[2]Manning WK， Bonner WM. Isolation and culture of chondrocytes from human adult articular cartilage [J]. Arthritis Rheum， 1967， 10（3）： 235-259.

[3]Tew SR， Peffers MJ， McKay TR， et al. Hyperosmolarity regulates SOX9 mRNA posttranscriptionally in human articular chondrocytes [J]. Am J Physiol Cell Physiol. 2009， 297（4）：898-906.

[4]Qusous A， Parker E， Geewan C， Kapasi A， et al. Novel methods for the quantification of changes in actin organization in chondrocytes using fluorescent imaging and linear profiling [J].Microsc Res Tech. 2012， 75（7）：991-999.

[5]Stumm M， Boger E， Gaissmaier CG， et al. Genomic chondrocyte culture profiling by array-CGH， interphase-FISH and RT-PCR [J]. Osteoarthritis Cartilage. 2012， 20（9）：1039-45.

[6]Gr？ssel S， Rickert M， Opolka A， et al. Coculture between periosteal explants and articular chondrocytes induces expression of TGF-beta1 and collagen I [J]. Rheumatology （Oxford）. 2010， 49（2）：218-230.

[7]Sato M， Shin-ya K， Lee JI， et al. Human telomerase reverse transcriptase and glucose-regulated protein 78 increase the life span of articular chondrocytes and their repair potential [J]. BMC Musculoskelet Disord. 2012， 2；13：51.

[8]Musumeci G， Loreto C， Carnazza ML， et al. OA cartilage derived chondrocytes encapsulated in poly（ethylene glycol） diacrylate （PEGDA） for the evaluation of cartilage restoration and apoptosis in an in vitro model [J]. Histol Histopathol. 2011， 26（10）：1265-1278.

[9]Krawczak DA， Westendorf JJ， Carlson CS， et al. Influence of bone morphogenetic protein-2 on the extracellular matrix， material properties， ndgene expression of long-term articular chondrocyte cultures： loss of chondrocyte stability [J]. Tissue Eng Part A. 2009， 15（6）：1247-55.

[10]Yu SM， Kim HA， Kim SJ. 2-Deoxy-D-glucose regulates dedifferentiation through beta-catenin pathway in rabbit articular chondrocytes [J]. Exp Mol Med. 2010， 31； 42（7）：503-13.

編輯/張燕