摘要：目的 探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與納米晶膠原基骨復(fù)合體在骨壞死修復(fù)中的效果。方法 制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與納米晶膠原基骨復(fù)合體，取23只雜種犬建立雙側(cè)股骨頭壞死動(dòng)物模型，隨機(jī)分為三組?？瞻捉M不做任何治療；單純納米骨植入組植入納米骨；納米骨+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組植入復(fù)合了干細(xì)胞的納米骨。對(duì)植入后4、8、12w的股骨頭行影像學(xué)觀察以及組織學(xué)觀察。結(jié)果 X射線(xiàn)檢查：植入后12w，空白組犬股骨頭有塌陷；單純納米骨植入組充填區(qū)與周?chē)M織區(qū)別不明顯，周邊有新生骨小梁；納米骨+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合體植入組充填區(qū)近似周?chē)M織，充填區(qū)分布有骨小梁。組織學(xué)觀察：4w時(shí)，空白組股骨頭壞死區(qū)無(wú)明顯變化，其他兩組植入物降解和新骨替代；8w時(shí)，空白組股骨頭負(fù)重區(qū)軟骨面部分缺損，其他兩組壞死區(qū)初步修復(fù)，可見(jiàn)成骨和材料降解；12w時(shí)，空白組壞死區(qū)仍未修復(fù)，部分股骨頭有塌陷，其他兩組壞死區(qū)修復(fù)，納米骨+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入組骨小梁結(jié)構(gòu)形成。結(jié)論 單純納米骨植入組和納米骨+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入組在股骨頭壞死成骨方面效果優(yōu)于空白組，納米骨+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入組成骨更佳。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與納米晶膠原基骨復(fù)合體對(duì)早期股骨頭壞死的治療有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；納米晶膠原基骨；股骨頭壞死；犬

股骨頭壞死是一種對(duì)髖關(guān)節(jié)具有特殊破壞性的退行性病變，病程長(zhǎng)且致殘率高，嚴(yán)重危害人民的健康。對(duì)于成人早期股骨頭壞死，行人工關(guān)節(jié)置換尚為期過(guò)早，因此如何有效地防止疾病的進(jìn)一步發(fā)展，保護(hù)股骨頭，延緩髖關(guān)節(jié)置換的手術(shù)時(shí)間，是值得關(guān)注的問(wèn)題。股骨頭壞死早期病程長(zhǎng)，在進(jìn)展至退行性髖關(guān)節(jié)病變晚期的3～5年間是可以逆轉(zhuǎn)的，早期發(fā)現(xiàn)并給予一種安全、有效、微創(chuàng)的治療是醫(yī)患雙方共同追求的目標(biāo)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一類(lèi)存在于骨髓基質(zhì)中的多能成體干細(xì)胞，大量研究證明BMSCs不僅具有良好的成骨細(xì)胞分化潛能和高成骨活性，還可分化成為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種間葉組織細(xì)胞。另外BMSCs具有獲取方便，易于體外純化擴(kuò)增，易于基因修飾，不存在免疫排斥問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)。因此，BMSCs是目前骨組織工程的最佳種子細(xì)胞[1]。骨壞死的病理轉(zhuǎn)歸中，血液供應(yīng)的中斷是最終引起臨床改變的決定因素。清除壞死病灶并盡可能重建血供是治療骨壞死的重要手段。在缺血壞死區(qū)，當(dāng)病灶清除后，骨修復(fù)區(qū)的血供重建則依賴(lài)于毛細(xì)血管網(wǎng)的新生。但由于患者從病變侵害形成至骨壞死出現(xiàn)均已經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的病程，局部的修復(fù)環(huán)境已發(fā)生了改變，缺乏利于血管形成的微環(huán)境，從而造成了患者即使充填了有效植骨材料，仍無(wú)法迅速及早期建立血供，進(jìn)而影響其最終的療效[2]。實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)、組織工程學(xué)的研究進(jìn)展，針對(duì)骨壞死病理學(xué)特點(diǎn)：局部骨組織血供中斷、BMSCs成骨分化能力減退，構(gòu)建適于骨壞死治療的骨移植替代物，提高早期骨壞死的治療效果。在分離純化犬BMSCs基礎(chǔ)上，將BMSCs與納米晶膠原基骨（nHAC）修復(fù)材料復(fù)合構(gòu)建組織工程骨，為組織工程技術(shù)治療骨壞死提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探索提高髓芯減壓植骨術(shù)治療骨壞死成功率的新途徑。

1 資料與方法

1.1一般資料 健康成年雜種犬23只，18～24月齡，體質(zhì)量（17.0±0.5）kg，雌11只雄12只，來(lái)源于連云港市東海縣種犬養(yǎng)殖場(chǎng)，普通環(huán)境。隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2方法 BMSCs與納米骨復(fù)合體的制備：取實(shí)驗(yàn)雜種犬骨髓分離培養(yǎng)BMSCs。nHAC在PBS中漂洗30min共3次，在95%的乙醇中浸泡2h，用無(wú)菌濾紙吸去多余液體。取第3代BMSCs長(zhǎng)滿(mǎn)后，消化細(xì)胞并將細(xì)胞配成2×109/L細(xì)胞懸液，D-Hanks液沖洗后，用2.5 g/L的胰酶+0.01%的EDTA消化，吹打后離心，以1500r/min轉(zhuǎn)速離心10min，去上清，加入少量培養(yǎng)液，振蕩后計(jì)數(shù)，制成濃度為1×109/L的細(xì)胞懸液。將材料放于96孔板內(nèi)，1粒/孔，復(fù)合于2.5mm×2.5mm×2.5mm納米骨上。每孔接種上述細(xì)胞懸液200μL進(jìn)行BMSCs與nHAC的復(fù)合培養(yǎng)，37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2～3d換液1次，備用[3]。

1.3動(dòng)物分組 取造模成功后的股骨頭壞死模型犬23只（骨膜部分剝離+髓腔破壞法成形左、右后肢股骨頭壞死模型），隨機(jī)分為空白組11只、單純納米骨植入組11只、納米骨+BMSCs復(fù)合體植入組11只。造模及治療方法：術(shù)區(qū)備皮后以30g/L戊巴比妥鈉麻醉，取俯臥位，常規(guī)消毒、鋪巾，髖關(guān)節(jié)后側(cè)切口，從臀大肌與闊筋膜張肌之間進(jìn)入，切斷外旋肌群，暴露關(guān)節(jié)囊，外旋股骨，顯露股骨頭，不切斷圓韌帶，髖關(guān)節(jié)不脫位，保護(hù)周?chē)M織，從股骨頸內(nèi)后側(cè)向股骨頭內(nèi)鉆孔。用直徑為3mm鉆頭向股骨頭內(nèi)鉆入約5.5mm，到達(dá)關(guān)節(jié)軟骨下?？瞻捉M不做任何治療，常規(guī)關(guān)閉傷口；單純納米骨植入組在所鉆空內(nèi)植入一2.5mm×2.5mm×2.5mm納米骨，常規(guī)關(guān)閉傷口；納米骨+BMSCs組在所鉆孔內(nèi)植入一2.5mm×2.5mm×2.5mm復(fù)合了干細(xì)胞的納米骨，常規(guī)關(guān)閉傷口。術(shù)后給予青霉素鈉肌注3d，6×104U/kg，1次/d，預(yù)防感染。

1.4檢測(cè)指標(biāo) ①大體觀察：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后一般情況觀察。普通X射線(xiàn)成像觀察：各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后4、8、12w的股骨頭攝X射線(xiàn)片，觀察股骨頭外形變化情況。②組織學(xué)觀察：術(shù)后12w，空氣栓塞法處死動(dòng)物，標(biāo)本經(jīng)處理后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、Massion染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)VEGF。③主要觀察指標(biāo)：①犬術(shù)后大體觀察。②各組犬術(shù)后X射線(xiàn)觀察。③各組犬術(shù)后組織學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 實(shí)驗(yàn)選用健康成年雜種犬23只，造模成功23只，分為3組，術(shù)后無(wú)死亡，進(jìn)入結(jié)果分析23只。

2.2犬術(shù)后大體觀察 結(jié)果實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉清醒后正常飼養(yǎng)。術(shù)后6h即正常飲水進(jìn)食、正?；顒?dòng)，無(wú)跛行或癱瘓。其中5例術(shù)后出現(xiàn)傷口紅腫，后自行愈合，其他犬切口均Ⅰ期愈合。

2.3各組犬術(shù)后X射線(xiàn)觀察 空白組：4w股骨頭無(wú)明顯變化，8w股骨頭負(fù)重區(qū)軟骨面部分缺損，12w部分犬股骨頭有塌陷。單純納米骨植入組：術(shù)后4w充填區(qū)材料與周?chē)M織結(jié)合松散，周邊有反應(yīng)帶；8w后，充填材料與周?chē)M織邊界模糊；12w充填區(qū)與周?chē)M織區(qū)別不明顯，界限不清楚，周邊有新生骨小梁。納米骨+BMSCs復(fù)合體植入組：術(shù)后4w充填區(qū)界限清楚，周邊有一明顯的反應(yīng)帶；8w周邊反應(yīng)帶基本消失，開(kāi)始有骨小梁長(zhǎng)入充填區(qū)；12w充填區(qū)近似周?chē)M織，無(wú)明顯界限，整個(gè)充填區(qū)已分布有骨小梁，且排列基本規(guī)則。

2.4各組犬術(shù)后組織學(xué)觀察結(jié)果 空白組：術(shù)后4w，骨小梁稀疏變細(xì)，結(jié)構(gòu)紊亂，有碎片出現(xiàn)，骨小梁骨細(xì)胞陷窩空疏；8w后，骨小梁進(jìn)一步萎縮，結(jié)構(gòu)紊亂并出現(xiàn)大量斷裂骨小梁，偶可見(jiàn)骨小梁缺如，無(wú)新生骨小梁出現(xiàn)。12w，骨小梁大量崩解，可見(jiàn)較大范圍骨小梁缺失區(qū)域，無(wú)新生骨組織充填，骨髓纖維化變性，可見(jiàn)到股骨頭塌陷現(xiàn)象，塌陷股骨頭周?chē)w維組織包裹。

納米骨植入組：術(shù)后4w，周邊有少量成骨反應(yīng)，新生組織向中心部長(zhǎng)入；8w，周邊有一定量骨形成，周邊為骨形成帶；12w，材料與周?chē)M織邊界模糊，材料中骨組織長(zhǎng)入，材料少量降解，骨小梁替代，偶有新生骨髓腔形成。

納米骨復(fù)合BMSCs植入組：術(shù)后4w，充填區(qū)周?chē)腥庋拷M織形成，間充質(zhì)細(xì)胞大量增生，新生組織開(kāi)始呈網(wǎng)狀長(zhǎng)入充填物，周邊有明顯的成骨反應(yīng)，有較多的新骨形成，纖維肉芽樣組織向nHAC長(zhǎng)入；8w時(shí)，周邊新骨帶明顯增寬，成骨反應(yīng)向中心部推進(jìn)，材料降解速度遠(yuǎn)快于納米骨植入組；12w時(shí)，部分充填區(qū)為幼稚的骨小梁所占據(jù)，表面有較多的成骨細(xì)胞，部分充填區(qū)廣布相對(duì)較成熟的骨小梁，但較正常骨小梁粗、排列不夠規(guī)則，大量板層骨和新生骨髓腔形成，材料大部分降解。

3 討論

干細(xì)胞治療股骨頭壞死應(yīng)嚴(yán)格掌握適應(yīng)證，一般選擇病變?cè)缙诨颊?，早期病例指具有完好外形的股骨頭，根據(jù)ARCO分期，應(yīng)為I期II期病例\"不應(yīng)該有明顯的囊性改變，III期病例由于有股骨頭的塌陷，即使手術(shù)后有成骨表現(xiàn)，也難以阻止病變進(jìn)一步發(fā)展至骨關(guān)節(jié)炎。目前對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療股骨頭壞死機(jī)制的研究還僅限于由多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞分化這一環(huán)節(jié)上，對(duì)于壞死各階段的病理過(guò)程還可以在干細(xì)胞水平做更為深入的探索。

BMSCs是骨組織工程最佳的種子細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)采用BMSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨，并移植到骨壞死區(qū)域治療骨壞死，具有明顯優(yōu)勢(shì)。BMSCs不僅可以促進(jìn)血管形成，還可旁分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)血管再生。從而建立血管形成的良性循環(huán)，促進(jìn)組織工程骨的快速血管化，同時(shí)阻斷因缺血造成的骨壞死病理轉(zhuǎn)歸。對(duì)于骨壞死的診斷，普通X射線(xiàn)檢查是常規(guī)方法，但對(duì)其早期診斷價(jià)值不大。本實(shí)驗(yàn)中普通X射線(xiàn)主要用于觀察股骨頭壞死晚期的塌陷情況和局部骨小梁形成情況。實(shí)驗(yàn)采用的支架材料為nHAC，是在仿生的思路下和既有膠原-鈣磷鹽復(fù)合材料的基礎(chǔ)上制備的一種新型納米復(fù)合骨材料。在微結(jié)構(gòu)和成分兩方面都與天然骨有相似性，納米級(jí)的羥基磷灰石為主要礦物相；礦物與膠原分子自組裝成周期排列結(jié)構(gòu)；材料的孔隙結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨相同，孔隙率70%以上；分級(jí)結(jié)構(gòu)與天然骨相同.該材料化學(xué)性能和物理性能均符合人體內(nèi)環(huán)境要求，具有良好的生物相容性。本實(shí)驗(yàn)組織學(xué)結(jié)果顯示，nHAC在股骨頭局部病理環(huán)境中有誘導(dǎo)成骨活性的能力，不斷長(zhǎng)入充填區(qū)的新生組織含有大量具有成骨潛能的細(xì)胞，作用于新骨，隨著逐漸的降解，nHAC被形成的新骨所替代，說(shuō)明這種nHAC不僅能有效地提高骨壞死病理?xiàng)l件下股骨頭的骨修復(fù)能力，同時(shí)適宜新生組織的長(zhǎng)入并能很好地完成材料的骨替代過(guò)程。因此，nHAC具有較好的生物相容性和生物可降解性，有可能成為組織工程的優(yōu)良載體。復(fù)合BMSCs的nHAC在成骨方面更強(qiáng)。術(shù)后4w即有明顯的成骨反應(yīng)和新骨形成，比單純植入nHAC組成骨反應(yīng)出現(xiàn)早且成骨能力明顯提高。隨著活組織的長(zhǎng)入和材料的逐漸降解，新骨形成不斷向中心部延伸，12w基本修復(fù)了股骨頭的骨缺損區(qū)。臨床上采用BMSCs復(fù)合nHAC將為股骨頭壞死\"保留股骨頭\"治療提供新的材料、思路和方法，對(duì)早期股骨頭壞死的治療有較好的應(yīng)用前景。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的迅速發(fā)展，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究也會(huì)更加深入，促進(jìn)、支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)分化成熟的各種生物因子，模擬體內(nèi)微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有效的分布在股骨頭壞死局部等均將成為研究熱點(diǎn)，并將取得重大突破，從而為股骨頭壞死的微創(chuàng)治療開(kāi)辟新的紀(jì)元。

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編輯/許言