夏俊霞， 喬福元， 吉瓊梅， 蘇放明

1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)科，深圳518020

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢430030

3深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，深圳518000

近年來越來越多的研究［1－2］表明滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤障礙是引起子癇前期（PE）發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因，而子癇前期胎盤缺血缺氧進(jìn)一步加重了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞缺氧，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，形成惡性循環(huán)。體外的研究表明低氧可誘導(dǎo)培養(yǎng)的胎盤出現(xiàn)與子癇前期類似的病變［3］。我們的前期研究表明子癇前期胎盤組織骨橋蛋白（osteopontin，OPN）低表達(dá)，且隨病情加重其表達(dá)進(jìn)一步降低，推測OPN在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用［4－5］。本研究利用氣體混配低氧裝置，體外模擬子癇前期胎盤缺氧的低氧環(huán)境培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞，研究低氧對滋養(yǎng)細(xì)胞OPN表達(dá)的影響，以進(jìn)一步深入研究OPN在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1．1 主要試劑

人胎盤絨毛膜癌滋養(yǎng)細(xì)胞系BeWo細(xì)胞（購自武漢大學(xué)典型生物保藏中心）；DMEM／Ham’s F－12K培養(yǎng)液（美國HyClone公司）；免疫組化試劑盒（邁新生物公司）；鼠抗OPN單克隆抗體、鼠抗β－actin單克隆抗體（美國Santa Cruz生物技術(shù)公司）；氣體混配低氧裝置（QT－MTX－3）（長沙長錦科技有限公司）；氧氣、氮?dú)?、CO2（深特氣體）；日本 Olympus倒置顯微鏡；AB7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀（ABI公司）。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)

BeWo細(xì)胞在含15%胎牛血清的DMEM／Ham’s F12K培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)傳代，待實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生長融合達(dá)到70%時(shí)，進(jìn)行低氧實(shí)驗(yàn)。

1．3 低氧實(shí)驗(yàn)

1．3．1 低氧裝置 低氧裝置為氣體混配器，配套的培養(yǎng)盒有一進(jìn)氣孔和一出氣孔。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將低氧培養(yǎng)的細(xì)胞放入相應(yīng)的培養(yǎng)盒內(nèi)，由過氣孔充入經(jīng)氣體混配器混合后的低氧氣體（5%CO2、8%O2、87%N2）或（5%CO2、2%O2、93%N2），10min后密閉培養(yǎng)盒，移入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，24h或48h后收集各組細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．3．2 實(shí)驗(yàn)分組 BeWo細(xì)胞分3組培養(yǎng)：①正常對照組，BeWo細(xì)胞在正常培養(yǎng)液、常氧濃度下培養(yǎng)；②8%低氧濃度組，BeWo細(xì)胞在正常培養(yǎng)液、氧濃度為8%低氧條件下培養(yǎng)；③2%低氧濃度組，Be－Wo細(xì)胞在正常培養(yǎng)液、氧濃度為2%低氧條件下培養(yǎng)；8%和2%氧濃度及培養(yǎng)時(shí)間參照王巖巖等［6］的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1．4 方法

1．4．1 細(xì)胞免疫組織化學(xué)法（SABC）檢測 BeWo細(xì)胞用0．25%胰酶消化后，用F12K完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105／mL；在滅菌的培養(yǎng)皿中鋪上3塊細(xì)胞爬片，讓細(xì)胞貼片30min左右；放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，不同氧環(huán)境下分別培養(yǎng)24h和48h。分別取出培養(yǎng)皿予常規(guī)SABC前處理，用于SABC免疫組織化學(xué)染色程序。主要步驟為：加血清封閉液37℃下封閉25min；取出甩干封閉液，鼠抗OPN單克隆抗體（1∶200），室溫孵育40 min；生物素化羊抗鼠酶標(biāo)二抗（1∶200）室溫孵育45min；SABC室溫孵育45min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。用抗體稀釋液替代一抗進(jìn)行陰性對照，反應(yīng)呈陰性。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）觀察照相，運(yùn)用Image－Pro Plus Version 5．1彩色圖像分析系統(tǒng)，對每張切片的OPN免疫反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行吸光度值測定，并進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。

1．4．2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 收集不同氧環(huán)境下培養(yǎng)的BeWo細(xì)胞，按Trizol法（試劑盒購自Invitrogen公司，美國）提取總RNA。OPN mRNA水平通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測。引物均根據(jù)GenBank登錄的人目的基因cDNA序列，由上海英駿公司設(shè)計(jì)并合成。以β－actin作為內(nèi)參照同時(shí)擴(kuò)增。各目的基因引物序列、堿基位置、擴(kuò)增片段長度及PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度見表1。

表1 PCR擴(kuò)增的2對引物序列及擴(kuò)增片段的大小Table 1 Two pairs of primer sequences and the size of the amplified fragments in PCR

采用Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。各基因cDNA的初始量（模板原始濃度）的確定：以標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值對初始濃度（相對值）作圖（擬合直線），即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)結(jié)束，設(shè)置合適的基線（一般是3rd～15th cycle），設(shè)置閾值（一般為基線的10倍），獲得每個(gè)樣品的Ct值；也可由軟件自動分析，獲得每個(gè)樣品的Ct值。β－actin的表達(dá)量是恒定的，用ΔCt法來考查OPN表達(dá)的差異。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取每個(gè)樣品的平均Ct值進(jìn)行分析。以β－actin作為內(nèi)參照，用2－ΔΔCt方法分析基因表達(dá)相對變化結(jié)果 RQ（Relative Quantification）。

ΔΔCt＝低氧組ΔCt－常氧組ΔCt；RQ＝2－ΔΔCT

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 常氧及低氧培養(yǎng)對細(xì)胞形態(tài)的影響

低氧培養(yǎng)24h與48h后，分別在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，低氧24h細(xì)胞形態(tài)就發(fā)生了較大的改變，常氧環(huán)境下呈梭形或星形生長的BeWo細(xì)胞足突變短（8%O2條件下）甚至消失（2%O2條件下），胞體變圓，并聚集成簇。2%O2環(huán)境下生長的細(xì)胞形態(tài)變化比8%O2環(huán)境下更明顯（圖1），低氧48h與24h比較，細(xì)胞形態(tài)無明顯差別。

2．2 細(xì)胞免疫組化檢測

2．2．1 光鏡觀察結(jié)果 OPN蛋白在常氧、8%O2及2%O2條件下培養(yǎng)的BeWo細(xì)胞中均有表達(dá)，可見到OPN免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕褐色顆粒狀或點(diǎn)狀，主要表達(dá)定位于BeWo細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中（圖2）。

2．2．2 半定量分析 運(yùn)用Image－Pro Plus Version 5．1彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，3組細(xì)胞掃描視野和掃描面積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與常氧對照組相比，低氧24h，3組OPN的免疫陽性染色無顯著性差異（F＝22．04，P＞0．05）；但低氧48h后，8%O2組與2%O2組OPN的免疫陽性染色均變淺，平均吸光度值減?。ň鵓＜0．01），即低氧組細(xì)胞OPN的蛋白表達(dá)降低，差異顯著，同時(shí)2%O2組與8%O2組相比，OPN的免疫陽性染色更淺，即2%O2組OPN的蛋白表達(dá)低于8%O2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01，表2）。

表2 BeWo細(xì)胞OPN免疫反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度測定（±s）Table 2 The absorbance of OPN in BeWo cells treated with different concentrations of oxygen（±s）

表2 BeWo細(xì)胞OPN免疫反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度測定（±s）Table 2 The absorbance of OPN in BeWo cells treated with different concentrations of oxygen（±s）

與常氧組比較，＊P＜0．01；與8%O2組比較，△P＜0．01

OPN 免疫反應(yīng)物吸光度相對值組別2．95±0．18 2．99±0．17 8%O2 2．90±0．18 2．01±0．14＊2%O2 2．89±0．16 1．78±0．12 24h 48h常氧＊△

2．3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

低氧條件下培養(yǎng)的BeWo細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)水平呈不同程度的下降，低氧24h后，8%O2，2%O2組的細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)水平與常氧組相比RQ分別為：0．753 9和0．483 3；低氧48h后，8%O2，2%O2組的細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)水平與常氧組相比 RQ分別為：0．541 2和0．214 0。結(jié)果表明，隨著低氧時(shí)間延長，OPN表達(dá)量呈下降趨勢，其中以2%O2條件下下降更明顯（表3）。

圖1 BeWo細(xì)胞在不同氧濃度下的培養(yǎng)Fig．1 Culture of BeWo cells under different oxygen concentrations

圖2 OPN在不同氧濃度培養(yǎng)的BeWo細(xì)胞中免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物的表達(dá)分布（SABC法）Fig．2 The expression of OPN in BeWo cells treated with different concentrations of oxygen（SABC method）

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測BeWo細(xì)胞OPN mRNA的表達(dá)Table 3 The expression of OPN mRNA in BeWo cells detected by real－time fluorescent quantitative PCR

3 討論

3．1 人胎盤絨毛膜癌滋養(yǎng)細(xì)胞系BeWo細(xì)胞

人類滋養(yǎng)細(xì)胞來源的細(xì)胞系常用來作為研究滋養(yǎng)細(xì)胞功能的細(xì)胞模型［7］，這些細(xì)胞系大多數(shù)來源于惡性葡萄胎或絨毛膜癌的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如Jar、Jeg－3和BeWo，這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞均系滋養(yǎng)細(xì)胞來源，在滋養(yǎng)細(xì)胞功能方面可提供許多有用的信息。由于獲得胎盤原代滋養(yǎng)細(xì)胞比較困難，并且在分離和短期應(yīng)用后，細(xì)胞功能會發(fā)生一些潛在的變化，因此原代滋養(yǎng)細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用受到限制。吳維光等［8］的研究證實(shí)BeWo細(xì)胞可作為一種滋養(yǎng)細(xì)胞模型用于低氧與滋養(yǎng)細(xì)胞功能關(guān)系方面的研究。故本實(shí)驗(yàn)采用來源于人類胎盤絨毛膜癌的滋養(yǎng)細(xì)胞系BeWo細(xì)胞作為研究對象。

3．2 實(shí)驗(yàn)性低氧方法

實(shí)驗(yàn)性低氧方法有兩種，一種是在低氧環(huán)境中培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞或組織，也稱為環(huán)境低氧；另一種是在細(xì)胞或組織培養(yǎng)液中加入鐵的螯合劑或二氯化鈷，阻斷氧信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，模擬低氧信號傳給細(xì)胞，也稱為細(xì)胞低氧［9］。環(huán)境低氧方法由于需要特殊的培養(yǎng)設(shè)備和低氧濃度的混合氣體，限制了其在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。新近由長沙長錦科技有限公司生產(chǎn)的氣體混配缺氧裝置（QT－MTX－3）性能與吳維光等［8］研究使用的低氧裝置可調(diào)式培養(yǎng)箱基本雷同，但其價(jià)格便宜，配置氣體方便，故本研究中使用氣體混配低氧裝置（QT－MTX－3）調(diào)配需要的氧濃度，進(jìn)行細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞低氧培養(yǎng)。

3．3 胎盤絨毛的低氧現(xiàn)象與子癇前期

胎盤的功能單位絨毛可分為2種：漂浮絨毛（漂浮在母體血液中）和錨定絨毛（錨定于子宮壁），均由滋養(yǎng)層細(xì)胞沿不同的轉(zhuǎn)化途徑分化而成。在錨定絨毛中，大多數(shù)滋養(yǎng)層細(xì)胞保持為單個(gè)細(xì)胞，并可脫離基底膜相互聚集形成細(xì)胞柱。位于滋養(yǎng)層細(xì)胞柱遠(yuǎn)端的滋養(yǎng)層細(xì)胞可粘附并侵入子宮壁［10］。在此過程中OPN介導(dǎo)子宮－胎盤界面的細(xì)胞粘附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用以調(diào)節(jié)胚胎滋養(yǎng)層侵襲的深度［11］。

在妊娠早期階段，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤子宮蛻膜建立胎盤床是一個(gè)復(fù)雜且難以理解的過程。在此過程中，流向胎盤的血液是相對受限的，故妊娠早期的胚胎發(fā)育及胎盤形成是在相對低氧的環(huán)境下進(jìn)行的［12］。母胎界面的滋養(yǎng)細(xì)胞的局部氧壓隨植入進(jìn)程而變化。胚胎植入早期，絨毛間隙和子宮內(nèi)膜中的氧壓僅為10～40mmHg；隨著滋養(yǎng)層細(xì)胞對于子宮螺旋動脈的改建，其周圍的氧壓達(dá)到90～100 mmHg，母體子宮內(nèi)膜和螺旋動脈的改建在孕8～12周達(dá)到高峰［10］。由此可見，滋養(yǎng)細(xì)胞早期發(fā)育是在低氧環(huán)境下進(jìn)行的，隨著浸潤程度的加深，必將遭受由相對低氧向常氧濃度的轉(zhuǎn)變過程，實(shí)際上是胎盤絨毛缺血再灌注的過程，而缺血再灌注會導(dǎo)致活性氧自由基的生成。在病理情況下，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤表淺，對子宮螺旋動脈的侵入不足致螺旋動脈重鑄不良甚至失敗，導(dǎo)致胎盤血流灌注不足和缺血缺氧，進(jìn)一步加重絨毛缺氧，影響整個(gè)胎盤的功能，最終導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生［13］。

3．4 低氧對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響與子癇前期的關(guān)系

足月絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞在低氧環(huán)境下培養(yǎng)48h的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)小泡、溶酶體、線粒體增多，并且電子密度較高；細(xì)胞表面的微絨毛稀少、變短，分布不均［14］；低氧可增加滋養(yǎng)細(xì)胞前列腺素H（PGH）合成酶Ⅱ的表達(dá)，而對PGH合成酶Ⅰ的表達(dá)無影響，最終增加PGE2及血栓素的合成與釋放［15］；將足月胎盤組織在2%O2條件下培養(yǎng)，可顯著增加其中合體滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤壞死因子α（TNF－α）、白介素－1α及白介素－1β的生成［16］；這些細(xì)胞因子的過量分泌引致內(nèi)皮細(xì)胞損傷失活，與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)［17］。Soleymanlou等［3］成功證明低氧可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的胎盤出現(xiàn)與子癇前期胎盤組織類似的改變，而且在基因表達(dá)模式上兩者的情形亦相似，推測可能系通過低氧誘導(dǎo)因子引發(fā)類似的病變，但具體的作用機(jī)制仍然未明。

本研究結(jié)果表明：在不同氧濃度的環(huán)境下Be－Wo細(xì)胞對低氧反應(yīng)敏感，外觀形態(tài)在低氧環(huán)境下發(fā)生明顯改變，如足突變短甚至消失，胞體變圓并聚集成簇，BeWo細(xì)胞形態(tài)的改變直接影響細(xì)胞功能的正常發(fā)揮；同時(shí)亦反映出BeWo細(xì)胞在極度缺氧條件下依然可以存活，這與文獻(xiàn)報(bào)道的相符［18－19］。OPN在各組BeWo細(xì)胞中均有表達(dá)，其免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要表達(dá)定位于胞質(zhì)和胞膜中，這與Briese等［20］的研究結(jié)果一致；低氧對滋養(yǎng)細(xì)胞OPN蛋白和mRNA的表達(dá)影響呈現(xiàn)出濃度時(shí)間依賴性，即隨著氧濃度的降低和缺氧時(shí)間的延長，OPN表達(dá)呈顯著下降趨勢，類似于OPN在子癇前期胎盤組織的表達(dá)隨病情加重而進(jìn)一步降低［4－5］。由此我們推測持續(xù)低氧伴隨氧濃度的下降導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞OPN表達(dá)降低，可能是子癇前期胎盤低氧對滋養(yǎng)細(xì)胞功能影響的重要機(jī)制之一。

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