童 松， 熊南翔△， 沈建英

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢430022

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系組織胚胎學(xué)教研室，武漢430030

N2a細(xì)胞（Neuro－2acells）是小鼠神經(jīng)嵴源性細(xì)胞，目前已經(jīng)被大量用于研究神經(jīng)細(xì)胞的分化、軸突生長(zhǎng)及信號(hào)通路。該細(xì)胞經(jīng)過血清剝奪或者其他的方法可在短時(shí)間內(nèi)改變信號(hào)通路分子的表達(dá)從而使細(xì)胞分化、軸突生長(zhǎng)［1］。目前有關(guān)N2a細(xì)胞的培養(yǎng)主要有2種方法：一種是用DMEM＋10%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)；另一種是用 DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)［2－4］。我們采用2種不同的方法培養(yǎng)N2a細(xì)胞，觀察該細(xì)胞在增殖、分化、粘附、遷移、自發(fā)凋亡方面的差異，旨在尋求最適合培養(yǎng)N2a細(xì)胞的方法。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

N2a細(xì)胞（由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系王建枝教授贈(zèng)送）、高糖DMEM培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，美國(guó) Hyclone公司）、Opti－MEM 減血清培養(yǎng)液（Opti－MEM Reduced－Serum Medium，美國(guó)Gibco公司）、胎牛血清（FBS，美國(guó) Gibco公司）、噻唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Amresco公司）、基質(zhì)膠（Matrigel，美國(guó)BD公司）、AnnexinⅤ－FITC／PI試劑盒（上海貝博公司）。

1．2 N2a細(xì)胞的分組與培養(yǎng)

取凍存的N2a細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇后分為2組，第1組細(xì)胞用DMEM＋10%FBS培養(yǎng)并傳代；第2組細(xì)胞用DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS培養(yǎng)并傳代，連續(xù)培養(yǎng)2周。

1．3 MTT實(shí)驗(yàn)

N2a細(xì)胞以1．0×105／mL密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0．1mL，分別于接種后1、2、3、4、5d進(jìn)行 MTT檢測(cè)。每孔加20μL MTT（5mg／mL），混勻，37℃條件下培養(yǎng)4h，小心吸棄上清，每孔加150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，充分溶解結(jié)晶，紫外分光光度計(jì)490nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度值（A值），每孔設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1．4 細(xì)胞形態(tài)觀察及分化細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞接種于6孔板中，在2種培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后于相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并統(tǒng)計(jì)分化細(xì)胞數(shù)目。應(yīng)用Image J軟件分析細(xì)胞分化率［5］。每組至少統(tǒng)計(jì)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算分化細(xì)胞所占比例，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1．5 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

96孔培養(yǎng)板中分別加入50μL Matrigel，37℃、5%CO2孵育1h，PBS沖洗2次，1%BSA封閉1h，PBS沖洗2次后加入1．0×105／mL密度的細(xì)胞懸液100μL在37℃、5%CO2培養(yǎng)30min。每組有一半孔不用PBS洗，另一半的孔用溫?zé)岬腜BS洗去未粘附的細(xì)胞，之后行上文提到的MTT實(shí)驗(yàn)，測(cè)各孔吸光度值（A值）。粘附率＝（粘附細(xì)胞A值／全部細(xì)胞A值）×100%。

1．6 劃痕實(shí)驗(yàn)

我們對(duì)檢測(cè)N2a細(xì)胞遷移能力的劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了部分改進(jìn)［6］：6孔板底部畫好標(biāo)記線，按1．0×105／mL濃度接種，培養(yǎng)細(xì)胞融合率達(dá)90%后，用10 μL加樣槍頭進(jìn)行劃痕損傷，PBS洗3次，鏡下拍照損傷區(qū)。在37℃、5%CO2條件下分別用DMEM＋4%FBS、DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋2%FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，鏡下拍照，用計(jì)算機(jī)分析遷移距離。

1．7 AnnexinⅤ－FITC／PI法檢測(cè)凋亡率

用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后離心，收集細(xì)胞，用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，離心后用400μL AnnexinⅤ結(jié)合液懸浮細(xì)胞，保持細(xì)胞密度為1×106／mL。在懸浮液中加入5μL AnnexinⅤ－FITC染色液，混勻，4℃避光孵育15min，最后加入10mL PI 4℃避光孵育5min，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13．0軟件統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)均數(shù)的比較采用Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組細(xì)胞增殖率的比較

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，2種培養(yǎng)液對(duì)N2a細(xì)胞的增殖作用沒有明顯的差異（圖1）。在1、2、3、4、5 d，DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS組的吸光度值分別為（0．34±0．04）、（0．47±0．05）、（0．78±0．07）、（1．33±0．06）、（1．76±0．05），DMEM＋10%FBS的吸光度值分別為（0．35±0．06）、（0．44±0．05）、（0．87±0．07）、（1．45±0．06）、（1．84±0．06）。DMEM ＋10%FBS組細(xì)胞增殖率與DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05）。

圖1 兩組細(xì)胞增殖能力的比較Fig．1 Comparison of the proliferation of N2acells between the two groups

2．2 兩組細(xì)胞分化率的比較

接種細(xì)胞24h后，DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS組的細(xì)胞多數(shù)呈圓形，分化細(xì)胞所占比例為（5．10±0．95）%；DMEM＋10%FBS組中多邊形及分化細(xì)胞較多，分化細(xì)胞所占比例為（10．82±1．95）%（圖2），表明 DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS培養(yǎng)液可降低細(xì)胞自分化比例。

圖2 兩組細(xì)胞分化率的比較（倒置相差顯微鏡，×200）Fig．2 Comparison of the differentiation rate of N2acells between the two groups（Inverted phase contrast microscope，×200）

2．3 兩組細(xì)胞粘附能力的比較

DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS組的細(xì)胞粘附率為（64．00±4．56）%，DMEM＋10%FBS組的細(xì)胞粘附率為（74．00±2．64）%，表明 DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS組的細(xì)胞粘附能力較DMEM＋10%FBS組降低。

2．4 兩組細(xì)胞遷移能力的比較

在增殖實(shí)驗(yàn)中我們得知兩組細(xì)胞增殖率相同，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們可以排除增殖對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。我們將低濃度血清的培養(yǎng)液用于本實(shí)驗(yàn)，這與正常血清濃度培養(yǎng)液相比降低了細(xì)胞增殖，與無血清培養(yǎng)液相比又抑制了細(xì)胞分化。使用低濃度血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，結(jié)果顯示DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋2%FBS組向劃痕部位遷移的細(xì)胞數(shù)（97±14）與DMEM＋4%FBS組的細(xì)胞數(shù)（107±25）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

2．5 兩組細(xì)胞自發(fā)凋亡率的比較

兩組細(xì)胞用AnnexinⅤ－FITC／PI染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢查發(fā)現(xiàn)，DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS組細(xì)胞凋亡率為（3．84±0．82）%，DMEM＋10%FBS組細(xì)胞凋亡率為（3．42±0．61）%，兩組凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖3 兩組細(xì)胞遷移能力的比較Fig．3 Comparison of the migration of N2acells between the two groups

圖4 兩組細(xì)胞自發(fā)凋亡率的比較Fig．4 Comparison of spontaneous apoptosis of N2acells between the two groups

3 討論

N2a細(xì)胞由Klebe與Ruddle于1969年通過A株白鼠的自發(fā)性腫瘤建立而成［7］，該細(xì)胞因其轉(zhuǎn)染易感并大量表達(dá)微管蛋白等特點(diǎn)，在神經(jīng)細(xì)胞分化，軸突生長(zhǎng)及信號(hào)通路領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。培養(yǎng)液是細(xì)胞體外賴以生長(zhǎng)、分化、增殖的重要因素，不同細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液需求不同，選擇相適應(yīng)的培養(yǎng)液是提高細(xì)胞在體外培養(yǎng)成活率及實(shí)驗(yàn)成功率的關(guān)鍵因素之一。但是關(guān)于N2a細(xì)胞培養(yǎng)液的選擇方面目前還沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，最常見的用于N2a的培養(yǎng)液有2種：DMEM＋10%FBS與 DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS，這2種培養(yǎng)液在N2a細(xì)胞的培養(yǎng)中均被廣泛運(yùn)用，但是關(guān)于N2a細(xì)胞培養(yǎng)2種培養(yǎng)液的適用條件及各自的優(yōu)缺點(diǎn)并未見報(bào)道。

我們運(yùn)用這2種不同的培養(yǎng)液來培養(yǎng)N2a細(xì)胞，并觀察2種不同培養(yǎng)方法下N2a細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、粘附能力、遷移能力、自發(fā)凋亡的差異。結(jié)果顯示，DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS培養(yǎng)液與DMEM＋10%FBS相比，可使N2a細(xì)胞保持較低的分化率與粘附力，在增殖、遷移、自發(fā)凋亡方面2種培養(yǎng)液對(duì)該細(xì)胞的作用相似。細(xì)胞粘附分子與細(xì)胞分化可以相互作用，相互影響［8］，我們推測(cè)本實(shí)驗(yàn)中DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS組N2a細(xì)胞粘附力與分化率的下降可能與調(diào)節(jié)粘附與分化的共同信號(hào)通路PI3K／AKT有關(guān)；DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS培養(yǎng)液具有較低濃度的血清反而可抑制自分化，其原因可能與Opti－MEM 的 成 分 有 關(guān)。Opti－MEM 是 EMEM（Eagle’s minimum essential medium）的改良版，其中使用了4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和碳酸氫鈉進(jìn)行緩沖，并添加次黃嘌呤、胸苷、丙酮酸鈉、L－谷氨酰胺、微量元素和生長(zhǎng)因子等，這些營(yíng)養(yǎng)元素加強(qiáng)了血清對(duì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用，將普通培養(yǎng)液換成Opti－MEM培養(yǎng)細(xì)胞，可使培養(yǎng)液中血清的用量減少一半以上。

N2a細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后具有較好的分化能力，未經(jīng)誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞分化率各家報(bào)道不一，多在4%～14%之間［2，9］。造成這種差異原因可能與細(xì)胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)方式不同有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS培養(yǎng)液組因其具有較低的分化率，與DMEM＋10%FBS相比，它更適合用于誘導(dǎo)N2a分化的實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)往往要求空白對(duì)照組的細(xì)胞保持較低的分化率。在用N2a細(xì)胞研究神經(jīng)分化及細(xì)胞粘附的實(shí)驗(yàn)中，建議首選DMEM／Opti－MEM（1∶1）＋5%FBS培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞體外培養(yǎng)。在其他關(guān)于N2a實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)液的選擇有待我們進(jìn)一步去探索與研究。

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