錢振杰，張 恒，陳 敬

(珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東珠海 519015)

唾液酸(Sialic Acid，SA)是一類神經(jīng)氨酸的衍生物，廣泛存在于多種生物組織中，主要包括N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)等。唾液酸主要的食物來源是母乳，也存在于牛奶、燕窩和雞蛋中［1］。在大部分哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)的唾液酸主要是N-乙酰神經(jīng)氨酸，其在乳中所占質(zhì)量比例可達(dá)到96%左右，因此通常把Neu5Ac稱為唾液酸［2］。唾液酸可通過提高大腦神經(jīng)細(xì)胞的信息傳遞速度促進(jìn)嬰兒的記憶力和智力發(fā)育，還可以提高兒童腸道吸收能力及兒童免疫力，所以部分嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)廠家以此為商品的宣傳點(diǎn)，將其產(chǎn)品的唾液酸含量標(biāo)示于包裝之上，一般產(chǎn)品中唾液酸的含量在100～200 mg/100g之間。唾液酸的分析方法很多，主要有分光光度法［3］(UV)、薄層層析法［4］(TLC)、高效液相色譜法［5-7］(HPLC)、脈沖電化學(xué)高效陰離子交換色譜檢測法［8］(HPAE-PAD)、膠束電動色譜法［9］(MEC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法［10］(CZE)以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［11］(HPLC-MS-MS)等。但是，尚沒有相關(guān)產(chǎn)品的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用液相色譜法，對水解后的嬰幼兒配方乳粉中唾液酸總量的測定方法進(jìn)行研究，通過系統(tǒng)優(yōu)化試樣水解、衍生和測定條件，建立乳粉中唾液酸含量測定的液相色譜法。該方法對嬰幼兒配方乳粉中唾液酸的檢測和標(biāo)示值的確定具有較好的指導(dǎo)意義。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備

e2695型液相色譜儀，配2475熒光檢測器(美國 Waters);分析天平(瑞士 梅特勒-托利多);HS250 Basic型多功能振蕩器(德國 IKA);HHS21-8-S恒溫水浴鍋(上海新苗)。

1.2 材料與試劑

N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)(含量＞98%，標(biāo)準(zhǔn)品);乙腈、四氫呋喃(色譜純);鄰苯二胺(OPD)、硫酸、氫氧化鈉、硫酸氫鈉及磷酸(分析純);實(shí)驗(yàn)用水為符合GB6682-2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的一級水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品溶液的制備

稱取約0.2 g～0.3 g(精確至0.001 g)樣品，置于25 mL比色管中，加入20.0 mL硫酸溶液(0.1 mol/L)，充分振蕩搖勻，置于80℃下水浴2 h，冷卻，加入0.625 mL氫氧化鈉溶液(6.0 mol/L)調(diào)節(jié)pH至近中性，加水定容，搖勻后靜置3 h，直至上層澄清。

2.2 衍生反應(yīng)

吸取水解后的上層清液1.00 mL置于15 mL離心管中，再加入1.0 mL濃度為5 mg/mL鄰苯二胺溶液(用0.1 mol/L硫酸氫鈉配制)，搖勻后置于80℃水浴下衍生50 min，冷卻，并用0.2 μm一次性針頭式濾頭過濾，裝瓶待測。

2.3 色譜條件

Agilent SB-AQ C18色譜柱(150mm ×4.6mm，5μm);流動相A:乙腈，流動相B相:1%四氫呋喃水溶液(含0.2%磷酸)皆為體積比;柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;熒光檢測器激發(fā)波長:231 nm，發(fā)射波長:465 nm。梯度洗脫程序如下:0 min(8% 流動相A)-5 min(8% 流動相A)-10 min(30%流動相A)-12 min(30%流動相A)-12.1 min(8%流動相A)-18 min(8% 流動相A)。

在上述色譜條件下，唾液酸的參考保留時間為8.35 min。樣品溶液的唾液酸液相色譜如圖1所示。

圖1 唾液酸樣品溶液液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of sialic acid sample solution

2.4 線性范圍

分別吸取1.00 mL唾液酸標(biāo)準(zhǔn)工作液系列于15 mL離心管中，按2.2步驟衍生，冷卻過濾，上機(jī)檢測。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖2。標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.00 μg/mL ～60.0 μg/mL線性范圍之內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=4 915x-1 645.3，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 8。

圖2 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線Fig.2 Standard curves of Sialic acid

2.5 精密度試驗(yàn)

對嬰幼兒配方乳粉樣品進(jìn)行了6次平行測定，含量及精密度結(jié)果如表1所示。此外，通過測定6次平行測定峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率(k)的比值，我們可得出3倍信噪比(3SD/k)為8.46 mg/100g，故將本方法的檢測限定為10.0 mg/100 g。

表1 唾液酸在乳粉樣品中的本底值的測定Tab．1 Determination results of samples

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取已知含量的嬰幼兒配方乳粉樣品分別加入低、中、高3個濃度水平的N-乙酰神經(jīng)氨酸對照品溶液。按上述方法進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算3個加標(biāo)水平的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。

表2 唾液酸在乳粉中的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)回收率和精密度數(shù)據(jù)Tab．2 Spike recovery rates of sialic acid in milk powder

3 結(jié)果與討論

3.1 水解條件的選擇

乳及乳品中的唾液酸主要以3種形式存在:游離態(tài)、蛋白結(jié)合態(tài)以及低聚糖結(jié)合態(tài)。本研究使用稀硫酸對樣品中所含唾液酸進(jìn)行水解處理。不同水解時間下待測物的含量結(jié)果如圖3所示，60～120 min時間范圍內(nèi)測定結(jié)果基本保持穩(wěn)定，故本方法選擇水解時間為120 min，以避免乳粉水解不完全的現(xiàn)象發(fā)生。

3.2 衍生劑濃度對實(shí)驗(yàn)的影響

唾液酸屬于九碳糖類物質(zhì)，無紫外吸收峰，但在酸性條件下可與OPD反應(yīng)，生成有熒光性質(zhì)的衍生物。唾液酸與鄰苯二胺的衍生反應(yīng)機(jī)理如圖4所示。

本研究針對不同濃度衍生劑存在下待測物的含量進(jìn)行分析測定，結(jié)果如圖5所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度的衍生劑有利于衍生反應(yīng)正向進(jìn)行，但同時過多存在的衍生劑也會造成色譜峰拖尾，影響目標(biāo)物質(zhì)的分離，故本方法選擇濃度為5 mg/mL的鄰苯二胺為衍生劑進(jìn)行反應(yīng)。

圖3 不同水解時間對測定結(jié)果的影響Fig.3 Effect of different hydrolysis times

圖4 唾液酸和OPD的衍生反應(yīng)機(jī)理圖Fig.4 Derivatization principles of Sialic acid and OPD

圖5 不同衍生劑濃度對測定結(jié)果的影響Fig.5 Effect of different Derivative concentration

3.3 衍生時間對實(shí)驗(yàn)的影響

衍生時間對測定結(jié)果的影響如圖6所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，衍生時間在40 min之前待測物峰面積隨時間增加不斷增大，當(dāng)時間超過60 min后則出現(xiàn)略微的下降。因此，最終選擇50 min作為最佳衍生時間。

圖6 不同衍生時間對測定結(jié)果的影響Fig.6 Effect of different derivative time

3.4 色譜條件的選擇

使用熒光分光光度計(jì)對衍生產(chǎn)物進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖7所示。最終我們選擇231 nm作為激發(fā)波長，465 nm作為發(fā)射波長對衍生產(chǎn)物進(jìn)行分析。

圖7 熒光檢測器條件的選擇Fig.7 The instrument conditions of Fluorescence detector

4 結(jié)論

本研究建立了嬰幼兒配方乳粉的柱前衍生熒光液相色譜檢測方法，對檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。該方法快速、簡便，選擇性和準(zhǔn)確性高、靈敏度和精密度也滿足實(shí)際工作需要，適用于嬰幼兒配方乳粉中唾液酸總量的測定。本方法可作為市售嬰幼兒配方乳粉中唾液酸標(biāo)簽值正確與否的確認(rèn)方法，具有很高的實(shí)用性。

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