【摘要】細(xì)胞生物學(xué)是一切生命科學(xué)的重要基礎(chǔ)學(xué)科。近年來(lái)，細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展迅速，其研究成果被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，成為現(xiàn)代生命科學(xué)的核心學(xué)科之一，本文就與細(xì)胞生物學(xué)密切相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)）及血清藥理學(xué)技術(shù)（中藥含藥血清制備）在關(guān)鍵步驟上做了較細(xì)致的探討。

【關(guān)鍵詞】兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；體外培養(yǎng)；中藥含藥血清；制備

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.11.685文章編號(hào)：1004-7484（2013）-11-6861-021體外培養(yǎng)兔視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞

組織培養(yǎng)工作始于1907年，美國(guó)動(dòng)物學(xué)家Ross Granville Harrison為解決“神經(jīng)纖維的起源問(wèn)題”，而設(shè)計(jì)出的“一種能在生活狀態(tài)下直接觀察正在生長(zhǎng)的神經(jīng)末端的方法”，即哈里斯懸滴培養(yǎng)法，后經(jīng)美國(guó)醫(yī)生M.T.Burrows和Alexis Carrel不斷的改進(jìn)和完善，組織培養(yǎng)技術(shù)得以迅速發(fā)展，作為一種研究組織和活細(xì)胞的良好方法，由于其具有的諸多優(yōu)越性，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)與藥學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，成為重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一。

視網(wǎng)膜色素上皮位于視網(wǎng)膜的最外層[1]，是由單層六角形的色素上皮細(xì)胞所構(gòu)成，它具有多種復(fù)雜的生化功能以及支持光感受器活動(dòng)的色素屏障功能，并具有對(duì)視網(wǎng)膜外層傳遞來(lái)自脈絡(luò)膜的營(yíng)養(yǎng)，和對(duì)光感受器外節(jié)脫落的膜盤(pán)及代謝產(chǎn)物進(jìn)行吞噬的功能，其代謝異常和喪失，可引起視網(wǎng)膜感覺(jué)層發(fā)生繼發(fā)性變性改變，甚至導(dǎo)致失明。在組織胚胎學(xué)上視網(wǎng)膜色素上皮層由神經(jīng)外胚葉發(fā)育而來(lái)，胚胎4周時(shí)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)色素顆粒，至第5周則完全充滿(mǎn)其中。體外培養(yǎng)的色素上皮細(xì)胞屬于貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞，其形態(tài)為扁平的多角形，細(xì)胞質(zhì)近中央處有圓形的細(xì)胞核，細(xì)胞之間緊密相靠、互相銜接，具有連接成片的能力。

1.1取材為了避免細(xì)胞的生長(zhǎng)，在摘取兔眼時(shí)不能通過(guò)碘酒消毒，因?yàn)榈饩浦械牡庥幸种萍?xì)胞生長(zhǎng)的作用。另外還要注意將眼球摘除之后要將其放入冰箱當(dāng)中，放置的時(shí)間要在15分鐘，并且在放置之前還要進(jìn)行慶大霉素生理鹽水的浸泡，這樣在色素上皮分離、視網(wǎng)膜神經(jīng)分離就比較容易。為了減少碘進(jìn)入兔眼視網(wǎng)膜的概率，此時(shí)應(yīng)該著重關(guān)注眼球內(nèi)層的色素上皮細(xì)胞。這一點(diǎn)很關(guān)鍵。如果發(fā)現(xiàn)摘取的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，那么在排除了生物因素、物理因素之后就要考慮到這方面的原因。

1.2分離進(jìn)行上述操作后，我們就要將其分離，此時(shí)將眼球球角鞏膜緣后的3毫米地方做一環(huán)形切口，將其去除晶體、角膜、玻璃體去除，力量一定要均勻，將眼科周?chē)模◤潱┑念^部鈍緣通過(guò)視網(wǎng)膜向視乳頭進(jìn)行輕刮，此時(shí)通過(guò)鑷子將視網(wǎng)膜上的神經(jīng)上皮去掉，這種方法是我們通過(guò)多次的實(shí)驗(yàn)總結(jié)出來(lái)的，通過(guò)這個(gè)可以干凈、徹底地將視網(wǎng)膜進(jìn)行分離。

1.3消化將去除視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的眼球掛置于自制的眼杯中（由橡膠瓶塞和針灸針制成），滴加0.25%的胰蛋白酶沒(méi)至距角鞏膜緣切口1mm處，放入二氧化碳孵箱中消化10-15min，消化時(shí)間可根據(jù)具體情況而定，如新制胰蛋白酶消化時(shí)間可相應(yīng)縮短。與先消化后分離相比，我們的方法可以較準(zhǔn)確地把握消化時(shí)間，同時(shí)消化洗脫下來(lái)的色素上皮細(xì)胞也較多，雜細(xì)胞較少。

1.4吹打我們總結(jié)了一下，吹打30-40次后就可以充分的將細(xì)胞制成懸液；另外在進(jìn)行沖洗時(shí)最好選用合成培養(yǎng)液如DMEM代替PBS緩沖液，目的是盡可能地模擬細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境，減少細(xì)胞離體后再培養(yǎng)時(shí)的貼壁時(shí)間。

1.5關(guān)于微生物污染組織細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)一般失敗的最主要的原因就是微生物的污染，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒(méi)有免疫能力，缺乏機(jī)體屏障，當(dāng)發(fā)生細(xì)菌、霉菌時(shí)缺少相應(yīng)的防御能力最終細(xì)胞出現(xiàn)死亡，鑒于這個(gè)原因，實(shí)驗(yàn)的成功就必須做好防止污染的工作，進(jìn)行操作時(shí)要做到無(wú)菌操作，并且確保各個(gè)環(huán)節(jié)都是無(wú)菌狀態(tài)。

我們的體會(huì)就是嚴(yán)格按要求操作，決不能馬虎、懶惰，更不能抱有僥幸心理。無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔而滅擦洗地面一次，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要75%酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。實(shí)驗(yàn)前認(rèn)真清洗（經(jīng)清潔液處理過(guò)的器具先用自來(lái)水沖洗20遍，之后一次蒸餾水清洗5遍，最后再用3次蒸餾水清洗3遍）、消毒培養(yǎng)用品；實(shí)驗(yàn)時(shí)也要保持無(wú)菌操作，如打開(kāi)或封閉瓶口等都應(yīng)在酒精燈近火焰處燒灼；拿取培養(yǎng)用品都應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成；現(xiàn)在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)大多數(shù)是通過(guò)二氧化碳孵箱，因此需要再次強(qiáng)調(diào)一下孵箱中的消毒的問(wèn)題，孵箱雖然為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了良好的環(huán)境，例如提供了恒定的二氧化碳、在維持PH值穩(wěn)定時(shí)也做的相當(dāng)?shù)牡轿?，但是開(kāi)放式的培養(yǎng)，就給細(xì)菌、真菌提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)境，因此做好孵箱中細(xì)菌防止工作很重要，如果孵箱中的存在著污染那么整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)工作就會(huì)功虧一簣。因此定期地對(duì)箱內(nèi)清潔，定期地將水槽中的無(wú)菌的蒸餾水進(jìn)行更換很重要。

由于在體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏一定的抵抗能力，因此要做好微生物污染的工作，為了提高微生物的免疫力，可以選擇在培養(yǎng)液中加入一定的抗生素。但是通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，加入抗生素的作用有限，并且也嘗試通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抗生素的沖擊療法、動(dòng)物體內(nèi)接種、加溫處理等，上述方法都是有限的，因此做好預(yù)防工作是勢(shì)在必行。

附：兔視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定6只家兔空氣栓塞法處死，隨即于無(wú)菌操作下摘除眼球，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液充分沖洗后，在角鞏膜緣后3mm處環(huán)形剪開(kāi)，棄眼前節(jié)和玻璃體，用顯微鑷輕輕撕去視網(wǎng)膜，加入0.25%胰蛋白酶，于37℃消化10-15min，后經(jīng)小牛血清終止消化，800r/min離心10min，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)液，接種于50mL培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2，90%濕度的孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，每3d換液一次，直到細(xì)胞融合，行1：2傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，經(jīng)細(xì)胞免疫化學(xué)抗角蛋白與抗S100染色進(jìn)行視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞鑒定，選擇1-2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)板準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×105個(gè)/ml待用。2中藥含藥血清（medicated serum）的制備

為在體外實(shí)驗(yàn)中能觀察到中藥經(jīng)體內(nèi)胃腸吸收、生物轉(zhuǎn)化后的綜合整體藥理效應(yīng)，日本昭和藥科大學(xué)田代真一教授于20世紀(jì)80年末首次提出“血清藥理學(xué)（serum pharmacology）”的概念[2]，具體是指將中藥或復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服，一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液，分離血清后用含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法。此法不僅可排除由于中藥復(fù)方粗制劑直接加入體外試驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的干擾，而且含藥血清能較真實(shí)地反映藥物在體內(nèi)的狀態(tài)，使體外試驗(yàn)?zāi)茌^好地重復(fù)在體試驗(yàn)的結(jié)果，它為科學(xué)地闡明中藥復(fù)方的作用及其機(jī)制提供了新的研究方法。

2.1供體動(dòng)物的選擇為避免種屬差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)偏差，我們選擇與培養(yǎng)細(xì)胞同種動(dòng)物（家兔）作為血清供體，具體方法：在性別、年齡、體重方面與細(xì)胞供體家兔保持一致；為保證各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于造模前處于相同的實(shí)驗(yàn)條件，我們給予各組同種正常血清（normal rabbit serum，NRS）孵化36h；鑒于生理、病理狀態(tài)下可能會(huì)產(chǎn)生較大的藥代動(dòng)力學(xué)差異，給予含藥血清供體家兔造模。

2.2給藥方案的制定首先采用與臨床實(shí)際給藥途徑相同的方法（灌胃）給藥；其次為提高體外實(shí)驗(yàn)體系中含藥血清的濃度，在給藥劑量上，我們結(jié)合臨床常用量、動(dòng)物體表面積比值及實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，設(shè)定成人臨床日用量的10倍和20倍（量效關(guān)系）作為最后的給藥劑量；最后在給藥時(shí)間及采血時(shí)間上，由于中藥及其復(fù)方成分復(fù)雜，血藥濃度及半衰期難以準(zhǔn)確測(cè)定，我們采用供體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前禁食8-12h，每天灌胃給藥2次，連續(xù)給藥3d，末次給藥后1h，心臟取血的方法獲得含藥血清[3]。

2.3血清的滅活和保存由于血清中所含生物活性物質(zhì)可能會(huì)對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生毒性及嚴(yán)重干擾作用，我們對(duì)血清進(jìn)行微孔濾膜（0.45μm、0.22μm）除菌，56℃水浴30min滅活，以去除非藥理性干擾；考慮到含藥血清長(zhǎng)期低溫（-20℃，2個(gè)月）保存后藥效會(huì)顯著降低，我們將新鮮制備的含藥血清置于4℃冰箱保存，以備隨時(shí)取用，剩余血清-70℃以下低溫冰箱長(zhǎng)期保存。參考文獻(xiàn)

[1]葛堅(jiān).眼科學(xué)（第2版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：63-65.

[2]田代真一.“血清藥理學(xué)”と“血清藥化學(xué)”-漢方の藥理學(xué)から始まつた藥物血中濃度測(cè)定の新しぃ世界，TDM研究，1988（5）：54.

[3]李儀奎.中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的若干問(wèn)題[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（2）：95-98.