摘 要：以楊木紙漿纖維為原料，采用纖維素酶水解法協(xié)同機(jī)械處理法制備出微/納纖絲（Micro/Nanofibrils）。酶處理制備微/納纖絲的影響因素按大小依次為：時(shí)間、加酶量、料液比。最佳工藝條件：處理時(shí)間為36 h，加酶量30 FPU，料液比為1∶40。酶解后纖維的結(jié)晶度為84.2%，纖維素含量為95.26%，再經(jīng)過纖絲進(jìn)行超聲和高壓均質(zhì)間歇式處理來制備微/納纖絲。從SEM圖可以看出，纖絲表面起毛、分絲帚化，次生壁中層S2上微纖絲暴露，分離出了細(xì)小纖維。纖維的直徑分布在25～55 nm，寬度方向已經(jīng)達(dá)到納米級(jí)纖絲要求。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；微/納纖絲；機(jī)械處理

中圖分類號(hào)：TQ340.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.11.002

21世紀(jì)以來，隨著資源的嚴(yán)重匱乏和人們對(duì)環(huán)保的日益重視，可再生生物質(zhì)資源的利用具有了重要意義[1]。纖維素是地球上極為豐富的可再生生物質(zhì)資源之一，占地球總生物量的40%[2-3]，廣泛應(yīng)用于造紙、塑料、炸藥、電工及科研等方面。從天然纖維中分離出的微/納纖絲具有高強(qiáng)度、高結(jié)晶度、高純度、生物可降解、親水性強(qiáng)等特性，因此，微/納纖絲在高性能復(fù)合材料中顯示出廣闊應(yīng)用前景。微/納纖絲（micro/nanofibrils）包括微纖絲（microfibril）和納米纖絲（nanofibril）兩種。微纖絲被定義為直徑在0.1～1 μm，長(zhǎng)度在5～50 μm的纖維，納米材料則包括至少一維空間的尺寸為納米級(jí)（1～100 nm）[4]。

微/納纖絲的制備方法有化學(xué)法、機(jī)械法、生物法、人工合成法、靜電紡織法、酶處理法等[5]。相比較來說，酶處理法制備微/納纖絲具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、設(shè)備要求相對(duì)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)勢(shì)[6]，且所用的試劑酶與纖維素酶均為可再生資源[7]，因此，酶處理工藝更適合今后的大量生產(chǎn)微/納纖絲。

本研究以楊木紙漿纖維為原料，通過纖維素酶協(xié)同機(jī)械法處理，致力于以環(huán)境友好方式制備出微/納纖絲，運(yùn)用高效液相色譜、X射線衍射儀和掃描電子顯微鏡對(duì)制備出的微/納纖絲進(jìn)行表征分析，研究其細(xì)化后的性能變化。

1 材料和方法

1.1 材 料

楊木紙漿纖維：購(gòu)置于江蘇某造紙廠，纖維素含量為77.44%，半纖維素含量為15.72%，酸不溶木素為5.1%，結(jié)晶度為68.2%。纖維素酶：購(gòu)置于寧夏和氏璧公司，是由青霉菌發(fā)酵液精制而成，濾紙酶活為48.86 FPU·g-1。主要試劑：檸檬酸、過氧化鈉、亞硫酸鈉、硫酸、3，5-二硝基水楊酸、偏重亞硫酸鈉等分析純均購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：高效液相色譜（美國(guó)安捷倫公司），高壓均質(zhì)儀（定制于日本某研究公司），超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（南京先歐儀器制造有限公司），馬爾文激光粒度儀（馬爾文公司），X射線衍射儀（島津/KRATOS公司），JSM-7600F場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本電子）等。

1.2 酶解楊木紙漿纖維中纖維素/半纖維素的測(cè)定[8]

稱?。?00.0±10.0） mg已用酶處理過的楊木紙漿纖維置于干燥皿中，加入（3.00±0.01） mL72%硫酸，充分潤(rùn)濕混勻。將干燥皿置于（30±3） ℃水浴中振蕩反應(yīng)（60±5） min，振蕩須保證所有納米纖維素浸潤(rùn)于硫酸溶液中，完全水解。水解完成后，從水浴槽中取出干燥皿，加入（84±0.04） g純水，將硫酸濃度稀釋至4%。將樣品置于高壓滅菌器中，溫度設(shè)置為121 ℃，時(shí)間60 min。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫。用已準(zhǔn)備好的磨成粉狀的脫水Ba（OH）2，中和樣品pH值至5～6。離心后，取上清液作高效液相分析用，從圖譜中計(jì)算出葡萄糖、木糖濃度。從而可以計(jì)算出樣品中纖維素和半纖維素的絕干百分比。公式（1）如下：

纖維素/半纖維素含量=×100%（1）

式中，C為水解后單糖的濃度，單位為g·L-1；MC為楊木紙漿纖維的含水率，0.087為水解液的總體積，單位為L(zhǎng)；0.3為酸水解原料的質(zhì)量，單位為g；0.9為纖維素和半纖維素水解葡萄糖對(duì)應(yīng)的系數(shù)。

用蒸餾水洗滌殘?jiān)?，后將殘?jiān)?05 ℃下干燥至恒質(zhì)量并稱質(zhì)量，將其作為酸不溶木質(zhì)素的質(zhì)量；取一定量的水解上清液用分光光度法在205 nm處測(cè)定其吸光度AOD，然后按式（2）計(jì)算相應(yīng)的酸溶木素。

酸溶木素=×8.7%（2）

1.3 楊木紙漿纖維預(yù)處理

（1）楊木紙漿纖維的粉碎。由于纖維過于粗，用植物粉碎機(jī)對(duì)楊木紙漿纖維再加工，過0.18 mm篩。

（2）化學(xué)處理[9]。由于楊木紙漿纖維中仍然有少量半纖維素、木素及其它雜質(zhì)，這會(huì)影響微/納纖絲的制備，因此要將其去除。選擇固液比為1∶30，在NaSO3濃度為3%，蒸煮時(shí)間為2 h，溫度為200 ℃，脫去楊木紙漿纖維中的木質(zhì)素，水洗至中性，收集濾渣；選擇固液比為1∶30，NaOH濃度為8%，堿處理時(shí)間3 h，溫度80 ℃，脫去楊木紙漿纖維中的半纖維素，水洗至中性，收集濾渣；選擇固液比為1∶40，H2O2濃度5%，處理時(shí)間1 h，溫度45 ℃，脫去果膠等雜質(zhì)，水洗至中性，收集濾渣。經(jīng)高效液相得出圖譜，通過公式（1）和（2）分別計(jì)算得出纖維素含量為92.85%、半纖維素含量為1.87%、木質(zhì)素含量為0.88%，適合作為酶解纖維素的底物。

1.4 正交試驗(yàn)

為了考察最優(yōu)條件，選擇加酶量、酶解時(shí)間和料液比作為考察因素，運(yùn)用3因素3水平作正交試驗(yàn)，確定微/納纖絲的最佳工藝參數(shù)，具體因素水平如表1所示。

1.5 纖維素酶解楊木紙漿纖維

將堿預(yù)處理后的纖維素與緩沖溶液以一定的料液比加入纖維素酶液，在適宜的溫度以及pH值下酶解反應(yīng)一定時(shí)間，達(dá)到纖維素酶的平衡聚合度，滅酶5 min，過濾，濾渣風(fēng)干，粉碎，即得楊木紙漿微/納纖絲。

1.6 機(jī)械法處理?xiàng)钅炯垵{纖維

由于纖維素酶選擇性地酶解掉無(wú)定形的纖維素而剩下部分纖維素晶體[10]，因此，可以用機(jī)械法加以輔助酶解微/納纖絲，以較為環(huán)保的方式獲得結(jié)晶度較高、粒徑較小的產(chǎn)物。本試驗(yàn)中采用超聲波粉碎儀和高壓均質(zhì)儀間歇式處理已酶解過的微/納纖絲以獲得質(zhì)量更優(yōu)的微/納纖絲。

1.7 X射線衍射分析（XRD）[11]

樣品按照X射線衍射儀的測(cè)試要求裝片。X光為銅靶，掃描步長(zhǎng)為0.05°，掃描范圍為5°～40°，5°·min-1。測(cè)試條件為電壓40 kV，電流30 mA，采用2θ/θ步進(jìn)掃描。根據(jù)Turley法計(jì)算試樣的結(jié)晶度[11]，計(jì)算公式為：

CrI=×100% （3）

式中，CrI為結(jié)晶度指數(shù)；I002為（002）晶格衍射角的極大強(qiáng)度；Iam為代表2θ角近于18°時(shí)非結(jié)晶背景衍射的散射強(qiáng)度。I002與Iam單位相同。

1.8 JSM-7600F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）分析

配制已制備好的微/納纖絲溶液，放入冷凍干燥箱中冷凍干燥48 h后取出并立即存放入干燥器中以備檢測(cè)微/納纖絲的長(zhǎng)度、粒徑、形態(tài)等[12-14]。臨界點(diǎn)干燥，噴金，放入JSM-7600F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)分析

本試驗(yàn)采用的纖維素酶由青霉菌發(fā)酵液精制而成，此種酶經(jīng)試驗(yàn)在50 ℃下酶解效率最好，因此本試驗(yàn)酶解溫度定為50 ℃[15-21]。采用3因素3水平的正交試驗(yàn)，確定制備微/納纖絲的最佳工藝參數(shù)，得到CrI較高的微/納纖絲。根據(jù)公式（3）和XRD圖譜算出每組試驗(yàn)的CrI，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，酶處理制備楊木紙漿微/納纖絲的影響因素依次為A>C>B，即時(shí)間、加酶量、料液比。最佳工藝條件為A2B2C1，即最佳工藝條件為加酶量30 FPU，處理時(shí)間為36 h，料液比為1∶40。由于酶中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，使原料中纖維素含量有所降低，可以通過適當(dāng)?shù)膲A處理來去除蛋白質(zhì)，再進(jìn)行機(jī)械處理以制備粒徑更小的微/納纖絲。

通過馬爾文激光粒度儀Zetasizer Nano對(duì)酶解后微/納纖絲的粒徑分布進(jìn)行測(cè)量。從圖1可以看出，溶液中去除蛋白前后的變化情況。

圖1（a）中有2個(gè)峰值，在80 ℃下進(jìn)行熱堿處理后得到圖1（b），圖1（b）有一個(gè)峰值，這說明，酶處理后的產(chǎn)物中蛋白質(zhì)已經(jīng)去除。因此，可以得出：圖1（a）中粒徑分布范圍在100～1 000 nm，光強(qiáng)小的峰值是試驗(yàn)材料中酶的粒徑范圍分布情況。從（a）、（b）兩圖中均可看出，酶處理后的產(chǎn)物粒徑分布范圍大都在1 m以上，說明酶處理后的微/納纖絲大部分還是聚集形態(tài)的纖絲束，還需要進(jìn)一步的機(jī)械法處理才能獲得粒徑分布范圍更小的納米纖絲。圖1（b）中1 m以上纖絲粒徑分布較圖1（a）變窄，這是由于纖維在熱堿溶液中能夠發(fā)生剝皮反應(yīng)（150 ℃下發(fā)生），引起纖維素降解。

按照正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，由計(jì)算可知纖維素酶水解后楊木紙漿纖維的CrI為84.2%，這表明纖維素酶水解作用破壞了纖維素的非結(jié)晶區(qū)，使酶解后的纖維CrI提高。去除蛋白后纖維素的含量為95.26%。纖維素酶水解后，纖維素的結(jié)晶度和含量均有所改善。

2.2 機(jī)械法再處理

盡管在本試驗(yàn)的最佳酶解條件下獲得纖絲的纖維素含量和結(jié)晶度提高較大，但是酶解的作用趨于緩和，在粒徑的提高方面明顯不夠。用機(jī)械法加以輔助酶解，不僅較之化學(xué)法污染更小，而且可以獲得更小粒徑的微/納纖絲[21]。

本試驗(yàn)采用超聲波粉碎儀和高壓均質(zhì)儀間歇處理酶解后的微/納纖絲。配制濃度為0.05%的酶解后的楊木紙漿纖維溶液100 mL（已達(dá)到微米級(jí)別，見圖2中（a）、（b）和（c）），選用1/2″探頭（探入式）、振幅為80 μm、處理時(shí)間90 min（分3次）、脈沖時(shí)間6 s、脈沖間隔4 s。打開高壓均質(zhì)儀的壓力閥，調(diào)整壓力至1 000～1 500 bar，分3組進(jìn)行均質(zhì)，每組5次，每次處理時(shí)長(zhǎng)約為2 min。超聲波處理和高壓均質(zhì)處理為間歇式，即：超聲波處理→高壓均質(zhì)處理→超聲波處理→高壓均質(zhì)處理→超聲波處理→高壓均質(zhì)處理。

2.3 楊木紙漿微/納纖絲的表征分析

采用JSM-7600F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），分別對(duì)酶解后和超聲波/高壓均質(zhì)儀處理后的楊木紙漿纖維的形態(tài)進(jìn)行研究，配制濃度為0.05%微/納纖絲溶液進(jìn)行冷凍干燥，48 h后放入掃描電鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示。

圖2中的（a）、（b）和（c）圖為酶處理后楊木紙漿纖維的SEM圖。從圖中可以看出，纖維比較疏松多孔，這說明酶處理已經(jīng)使纖維的初生壁和次生壁外層脫落。但是團(tuán)聚現(xiàn)象較嚴(yán)重，分散不均勻，粒徑分布大都在10 m左右，如圖（c）所示。因此，還需機(jī)械力輔助使纖維產(chǎn)生縱向分裂，破壞纖絲與纖絲之間的氫鍵作用以獲得分散均勻、粒徑達(dá)到納米級(jí)的納米纖絲。

圖2中的（d）、（e）和（f）圖為酶處理協(xié)同機(jī)械法處理?xiàng)钅炯垵{纖維的SEM圖。從圖中可以看出，經(jīng)過超聲波和高壓均質(zhì)間歇處理后的纖維已經(jīng)分離成纖絲狀。纖維素鏈上的主要功能基是羥基（—OH），羥基不僅對(duì)纖維素的超分子結(jié)構(gòu)有決定作用，而且也影響其化學(xué)和物理性能?！狾H基之間或—OH基與O—、N—和S—基團(tuán)能夠聯(lián)接，即氫鍵。因此，只有纖絲與纖絲間的氫鍵斷裂，才能獲得微/納纖絲。酶處理協(xié)同機(jī)械法處理纖維正是運(yùn)用于此，才制備出了如圖2中（d）～（f）納米級(jí)的纖絲。如圖2中（d）、（e）和（f）所示，纖絲具有較大的比表面積，并且長(zhǎng)徑比大，圖2（f）表明：纖維的直徑分布在25～55 nm，寬度方向已經(jīng)達(dá)到納米級(jí)纖絲要求。從圖2（d）、（e）和（f）中還可以看出，纖絲表面起毛、分絲帚化，這是因?yàn)榇紊谥袑覵2上微纖絲暴露，分離出了細(xì)小纖維。

3 結(jié) 論

（1）酶處理制備楊木紙漿微/納纖絲的影響因素按大小依次為：時(shí)間、加酶量、料液比，最佳工藝條件為：加酶量30 FPU，處理時(shí)間為36 h，料液比為1∶40。

（2）熱堿處理去除酶解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)，纖絲的CrI為84.2%，纖維素含量為95.26%。纖絲的CrI和含量均有所改善。

（3）采用超聲波粉碎儀和高壓均質(zhì)儀間歇處理酶解后的微/納纖絲，獲得產(chǎn)物達(dá)到納米級(jí)別，從電鏡圖中可看出，次生壁中層S2上微纖絲暴露，纖絲表面起毛、分絲帚化，分離出了細(xì)小纖維。纖維的直徑分布在25～55 nm，寬度方向已經(jīng)達(dá)到納米級(jí)纖絲要求。

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