摘 要：采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法，以馬鈴薯塊莖為主要的研究材料，分別采用浸染法和注射法將外源基因?qū)腭R鈴薯塊莖細(xì)胞中，然后進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。試驗結(jié)果表明，導(dǎo)入馬鈴薯塊莖細(xì)胞里的外源基因獲得了表達(dá)；浸染法的表達(dá)區(qū)域更加均勻，優(yōu)于注射法。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；塊莖；根癌農(nóng)桿菌；瞬時表達(dá)；GUS

中圖分類號：S532 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.11.001

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）俗稱“土豆”，是茄科茄屬多年生草本塊莖植物，原產(chǎn)于安第斯山區(qū)和智利沿海山地，是僅次于水稻、玉米、小麥的世界第四大重要糧食作物，具有分布廣泛、高產(chǎn)穩(wěn)定、適應(yīng)性強、營養(yǎng)豐富等特點，是一種兼具糧食、蔬菜、飼料以及工業(yè)原料等具有多種用途的經(jīng)濟(jì)作物[1]。

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法已經(jīng)在煙草、擬南芥、萵苣、番茄、草莓、梨等多種植物中得到應(yīng)用。利用此方法在葉片和果實中進(jìn)行的研究比較常見，但是沒有發(fā)現(xiàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對馬鈴薯塊莖進(jìn)行瞬時表達(dá)的研究報道。傳統(tǒng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法是目前研究馬鈴薯塊莖最常用的方法，但是其具有試驗周期長、耗資大、表達(dá)效率低下等缺點，因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法在馬鈴薯塊莖上可以得到應(yīng)用，將使得對馬鈴薯塊莖特異啟動子的研究變得更加方便快捷。

劉敏等[2]和孟楠等[3]采用注射法對草莓果實進(jìn)行瞬時表達(dá)均獲得成功，但是相對于草莓果實而言，馬鈴薯塊莖結(jié)構(gòu)更加致密，給試驗帶來了困難。本研究分別采用浸染法和注射法侵染馬鈴薯塊莖，以馬鈴薯葉片及煙草葉片為對照，通過GUS組織化學(xué)染色分析證明本研究的可行性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究采用鄂馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）3號品種（E3）的葉片、塊莖和煙草的葉片，作為轉(zhuǎn)化受體材料。

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株為LBA4404，中間載體為pBI-121。

1.2 農(nóng)桿菌的制備

取10 μL低溫保存的菌液，接種于10 mL液體YEB（內(nèi)含50 mg·L-1 Rif和50 mg·L-1 Kan）培養(yǎng)基中，于28 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)20～24 h。再取1 mL菌液接入40 mL液體YEB培養(yǎng)基，于28 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)大約6 h。

將40 mL菌液在4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min，去上清得到菌體。加入40 mLMS液體培養(yǎng)基（內(nèi)含200 μmol·L-1乙酰丁香酮）重新懸浮，將菌液OD600值調(diào)整至約0.8，室溫（22 ℃）靜置1 h后備用。

1.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)

將馬鈴薯（E3）葉片和塊莖用蒸餾水洗凈后，用75%酒精漂洗，再用無菌水漂洗1次。煙草為無菌組培苗，其葉片無需清洗。

1.3.1 浸染法 用手術(shù)刀片在煙草葉片和馬鈴薯葉片劃5～6處傷口，馬鈴薯塊莖縱切成1～3 mm薄片，用蒸餾水洗凈后放入菌懸液[LBA4404（pBI-121）]中，然后在真空泵中10 kPa抽濾20 min，取出后用無菌水沖洗1次[4]。將葉片放在鋪有用無菌水浸濕的濾紙的培養(yǎng)皿里，于16 h光照、8 h黑暗、22 ℃培養(yǎng)2 d[5]；塊莖只需暗培養(yǎng)2 d。

1.3.2 注射法 用1 mL無針頭的注射器針管用壓力將菌懸液[LBA4404（pBI-121）]注入完全展開的煙草和馬鈴薯葉片下表皮的2個葉脈之間[6]。對塊莖也同樣用1 mL注射器將菌懸液注入馬鈴薯塊莖中[7]。將葉片放在鋪有用無菌水浸濕濾紙的培養(yǎng)皿里，于16 h光照、8 h黑暗、22 ℃培養(yǎng)2 d；塊莖只需暗培養(yǎng)2 d。

1.4 GUS組織化學(xué)染色

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的試驗材料培養(yǎng)完成后，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色[8]。將葉片和薯片放入燒杯中，加入GUS染色液（20 mmol·L-1X-Gluc，0.2 mmol·L-1Na2HPO4，0.2 mmol·L-1NaH2PO4，0.1%TritonX-100，10 mmol·L-1K3Fe（CN）6，180 mmol·L-1EDTA）浸泡葉片和薯片，于37 ℃染色9 h后倒掉染色液，加入75%（V/V）工業(yè)酒精進(jìn)行脫色。脫色完成后拍照，并且記錄試驗結(jié)果。

1.5 GUS活性定量檢測

參照J(rèn)efferson[8]組織化學(xué)定位法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 GUS組織化學(xué)染色的形態(tài)表現(xiàn)

對用根癌農(nóng)桿菌處理后的葉片和塊莖進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，無論是用浸染法還是注射法處理的葉片和薯片都有藍(lán)斑的產(chǎn)生，肉眼識別的藍(lán)斑又可以分為點狀藍(lán)斑和片狀藍(lán)斑。在愈傷組織中藍(lán)色區(qū)域越大，就意味著更多的植物細(xì)胞被轉(zhuǎn)化，或者更強的GUS基因表達(dá)[9-10]。通過注射法處理的葉片和塊莖藍(lán)斑主要集中在注射區(qū)域（圖1B、E），這主要與注射方式有關(guān)，同時也與組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。馬鈴薯塊莖組織結(jié)構(gòu)致密，農(nóng)桿菌懸液不容易滲透，因此，藍(lán)斑主要出現(xiàn)在注射處。相對于注射法而言，浸染法處理的葉片和塊莖出現(xiàn)的藍(lán)斑則相對比較均勻（圖1C、F），當(dāng)然也與葉片和塊莖的組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)系。對照（圖1A、D）沒有藍(lán)色區(qū)域的出現(xiàn)。通過GUS組織化學(xué)染色可以得知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法在馬鈴薯塊莖中的應(yīng)用是可行的，并且浸染法的表達(dá)區(qū)域更為均勻。

2.2 蛋白含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)所測定595 nm的紫外吸收值對蛋白濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。595 nm的紫外吸收值與蛋白質(zhì)濃度之間的直線回歸方程為y=0.005 2x+0.003 8（R2=0.998 8），可用于蛋白質(zhì)含量的測定。

2.3 熒光測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)所測得的熒光信號值對4-MU濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。熒光信號值與4-MU濃度之間直線回歸方程為y=0.086 3x-0.002 8（R2=0.999 9），可用于4-MU濃度的測定。

3 討 論

近年來，為了更加快速和高效地研究外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)功能分析，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法在國內(nèi)外很多文獻(xiàn)中均有報道，但是還沒有在馬鈴薯塊莖中的報道。因此，該研究的目的是探索馬鈴薯塊莖GUS基因瞬時表達(dá)的方法，以用于將來快速分析馬鈴薯塊莖中的特異啟動子。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比較，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法避免了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法中繁瑣的組織培養(yǎng)過程，大大縮減了試驗時間，方法更加簡單快速。另外農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法還有表達(dá)效率高、安全性好等優(yōu)點。本研究對今后建立馬鈴薯塊莖瞬時表達(dá)體系，以及更加高效快捷地研究馬鈴薯塊莖特異啟動子都有著積極的作用。

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