摘要：介紹了一例奶牛支原體和大腸桿菌混合感染病例的診治情況。通過實(shí)驗(yàn)室檢查，對(duì)該牛場(chǎng)送檢病牛的各種臟器組織分別進(jìn)行了病原微生物學(xué)檢查、病原體的分離培養(yǎng)、主要致病菌的分離鑒定、細(xì)菌純培養(yǎng)物的染色鏡檢、藥物敏感性試驗(yàn)等檢測(cè)項(xiàng)目，確診為由支原體和致病性大腸桿菌混合感染所致的傳染性病例。

關(guān)鍵詞：支原體；大腸桿菌；混合感染；實(shí)驗(yàn)室診斷；奶牛

中圖分類號(hào)：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2013）12-0005-03

近年來，寧夏地區(qū)多個(gè)奶牛場(chǎng)發(fā)生了以呼吸系統(tǒng)疾病和關(guān)節(jié)腫大為主要特征的病例，病牛表現(xiàn)為突然發(fā)病甚至死亡，對(duì)牛場(chǎng)產(chǎn)奶量造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。2013年6月寧夏回族自治區(qū)銀川市某奶牛場(chǎng)發(fā)生了一起以成年母牛張口呼吸，呼吸頻率顯著增加，右前肢關(guān)節(jié)腫大導(dǎo)致死亡，隨后一只3月齡犢牛同樣出現(xiàn)呼吸道癥狀并且死亡。對(duì)該牛場(chǎng)送檢病牛的各種臟器組織，分別進(jìn)行了病原微生物學(xué)檢查、病原體的分離培養(yǎng)、主要致病菌的分離鑒定、細(xì)菌純培養(yǎng)物的染色鏡檢、藥物敏感性試驗(yàn)等檢測(cè)項(xiàng)目，確診為由支原體和致病性大腸桿菌混合感染所致的傳染性病例，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 臨床癥狀

成年母牛呼吸異常，出現(xiàn)張口呼吸，呼吸頻率顯著增加，可見右前肢關(guān)節(jié)腫大，于產(chǎn)前2周發(fā)生流產(chǎn)；犢牛表現(xiàn)為精神不振，出現(xiàn)呼吸道癥狀，關(guān)節(jié)明顯腫大。

2 病理學(xué)診斷

解剖病死牛觀察其病理變化。成年母牛肺臟蒼白，體積顯著萎縮，表面多皺褶，肺間質(zhì)顯著萎縮，肺臟缺乏充盈感或膨脹感；肺門淋巴結(jié)略有腫大、充血，切面暗紅色（圖1）；右前肢關(guān)節(jié)液顯著增多，顏色發(fā)黃甚至渾濁；肝臟顏色變深，質(zhì)地變脆，體積腫大邊緣鈍厚，在不同部位呈現(xiàn)大小不等灰白色炎性病灶（圖2）。發(fā)病犢牛經(jīng)剖檢后，可觀察到病牛肺臟體積腫大，出現(xiàn)纖維素性炎癥及出血性炎癥，質(zhì)地結(jié)實(shí)，切面多見血沫或液體（圖3）；肺臟與胸腔明顯粘連，胸腔有大量黃色、發(fā)出臭味的渾濁積液。肺門淋巴結(jié)腫大，切面呈紫紅色；其他臟器組織病變不明顯。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 培養(yǎng)基與試劑

8%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、SS瓊脂培養(yǎng)基（SS）、甘露醇高鹽培養(yǎng)基（MSA）、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（BPAB）、卵黃瓊脂培養(yǎng)基（EYAB）、哥倫比亞瓊脂（CNA）、BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基（SSA）等10種固體培養(yǎng)基，LIM液體培養(yǎng)基，支原體牛心湯復(fù)合培養(yǎng)基，配方為：牛心湯1 000 mL、蛋白胨10 g、氯化鈉5 mL、酵母提取液10 mL、無菌馬血清200 mL、1.25%醋酸鉈溶液20 mL、青霉素200 IU/mL 。平皿固體培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；頭孢噻呋鈉、阿米卡星、四環(huán)素、氨芐西林、恩諾沙星、新霉素、卡那霉素、先鋒霉素Ⅳ、先鋒霉素Ⅵ、克百特、氧氟沙星、鏈霉素、慶大霉素等13種藥物的藥敏片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。結(jié)晶紫、碘液、95%無水乙醇、石碳酸復(fù)紅；營(yíng)養(yǎng)肉湯，革蘭氏染色液，生理鹽水，藥敏紙片生化鑒定管等。

3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌分別取2頭病牛的肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、氣管、關(guān)節(jié)液等臟器組織新鮮切面分別接種到8%綿羊鮮血瓊脂、EMB、SS、MSA、EYAB、CNA、SSA等固體培養(yǎng)基上，37 ℃18～24 h進(jìn)行培養(yǎng)。其中在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)大量邊緣整齊或波狀、稍突起，表面光滑濕潤(rùn)，直徑1.0～2.0 mm、粉紅色或深紅色的圓形菌落，在EMB培養(yǎng)基上呈紫黑色帶金屬光澤的圓形菌落[2]，在普通瓊脂平板上呈灰白色，直徑1.5～2.0 mm的圓形菌落。

3.3 支原體的分離培養(yǎng)

無菌采取肺、肝、脾、腎等組織臟器，直接剪成小塊放在固體培養(yǎng)基上劃一直線，再用無菌鉑耳環(huán)在與其垂直方向劃線[3]。固體瓊脂平板置37 ℃潮濕需氧條件或在5%二氧化碳下培養(yǎng)48～96 h，用斜射光或放大25～40倍的立體顯微鏡檢查，若有特異菌落出現(xiàn)，應(yīng)選取散在的單個(gè)菌落用無菌解剖刀切下小瓊脂塊，用巴氏吸管小心地將菌落和周圍瓊脂吸入，再將其移入盛有2～3 mL的液體肉湯培養(yǎng)管培養(yǎng)48 h，將其培養(yǎng)物通過孔徑0.45 μL的濾膜過濾后作1：10和1：100稀釋，每一個(gè)稀釋液取0.05 mL涂布于瓊脂平板，即可得到純的支原體培養(yǎng)物。

3.4 形態(tài)與染色鏡檢

挑取典型單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色并逐一鏡檢，詳細(xì)記錄鏡檢結(jié)果。隨后分2次對(duì)典型菌落進(jìn)行了再次傳代培養(yǎng)，獲得了純培養(yǎng)物。

3.5 生化鑒定

挑取典型菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，觀察并記錄詳細(xì)結(jié)果。

3.6 藥敏試驗(yàn)

分別對(duì)2頭發(fā)病牛各臟器組織分離培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行紙片式藥敏試驗(yàn)，共選取13種常用及廣譜抗菌藥敏片進(jìn)行檢測(cè)。

4 結(jié)果與分析

4.1 鏡檢及生化試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌涂片染色檢查為革蘭氏陰性、大小一致的粉紅色的短小桿菌，初步鑒定為大腸桿菌。作生化試驗(yàn)對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明符合大腸桿菌的特征（見表1）。

4.2 支原體培養(yǎng)結(jié)果

在高血清量的復(fù)雜培養(yǎng)基上有細(xì)菌生長(zhǎng)，在固體培養(yǎng)基上菌落呈油煎荷包蛋樣特征性外觀[4]，結(jié)果見圖4。

4.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

克百特、先鋒VI高敏，氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢噻呋鈉、四環(huán)素中敏，其他藥物效果不明顯（表2）。

5 小結(jié)與討論

根據(jù)檢測(cè)法確定了在成年母牛和犢牛的肺臟、肺門淋巴結(jié)、氣管、關(guān)節(jié)液等組織中均檢測(cè)到了支原體和致病性大腸桿菌。該牛場(chǎng)成年母牛和犢牛所發(fā)病例均為支原體、致病性大腸桿菌混合感染所致的傳染性疾病。大腸桿菌和支原體都是條件性致病微生物。奶牛大腸桿菌性呼吸道炎癥是由于母牛的飼養(yǎng)管理不良或在產(chǎn)后機(jī)體抵抗力下降的情況下，致病性大腸桿菌侵入機(jī)體而引起呼吸異?；蚝粑щy，引發(fā)早產(chǎn)，同時(shí)病牛發(fā)生關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大或積液[6]。犢牛感染后表現(xiàn)為纖維素性肺炎或支氣管肺炎[7]。支原體是我國(guó)奶牛和育肥牛新出現(xiàn)的一種致肺炎、繼發(fā)關(guān)節(jié)炎的病原因子[8]。該病原體于1961 年首次在美國(guó)患有乳房炎的病牛中分離出來[9]，1976 年被描述為致呼吸道疾病的病因[10]，目前在歐洲和北美洲流行并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11，12]。目前已被認(rèn)為是育肥牛、青年奶牛與犢牛呼吸道疾病與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的重要病因。它不僅可以導(dǎo)致牛的急性呼吸系統(tǒng)疾病，還可以導(dǎo)致持續(xù)感染，以慢性支氣管肺炎伴有肺干酪樣或凝固性壞死病變?yōu)椴±硖卣?，常與細(xì)菌、病毒協(xié)同作用[13]。當(dāng)牛場(chǎng)管理不善，如舍棚過度擁擠、通風(fēng)不良、溫度太高等氣候因素將加劇病情，臨床上對(duì)多種抗生素的治療效果很差[14]。

綜上所述，當(dāng)致病性大腸桿菌和支原體混合感染引起奶牛肺炎及關(guān)節(jié)炎時(shí)，為牛群類似病例的有效治療與防控帶來困難。從降低相關(guān)病例的發(fā)病率、病死率及減少損失等角度考慮，建議采取綜合性防控措施。如選擇有效藥物，最好是牛場(chǎng)先前并未使用但藥效同樣可靠的藥用于群體的平時(shí)藥物預(yù)防，配合有效的衛(wèi)生消毒工作及良好的飼養(yǎng)管理如防寒保暖，以有效防止此類病例的發(fā)生與流行。對(duì)病牛做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療，尤其是要選擇藥敏試驗(yàn)推薦的有效藥物，如克百特、先鋒霉素Ⅵ進(jìn)行治療。

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