摘要：利用PCR方法克隆瑞氏木霉（Trichoderma reesei）外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）啟動子序列，以pSK載體為骨架，構(gòu)建了pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達載體，并成功轉(zhuǎn)入到綠色木霉（T. viride）Sn-9106中。通過對綠色木霉Sn-9106進行遺傳改造，為纖維素酶基因在木霉中同源重組表達提供遺傳轉(zhuǎn)化平臺。

關(guān)鍵詞：綠色木霉（Trichoderma viride）；cbhⅠ啟動子；綠色熒光蛋白；外源基因表達

中圖分類號：Q786；Q939.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3180-03

纖維素酶在木質(zhì)纖維素資源化利用過程中發(fā)揮著重要的作用。目前纖維素酶存在酶活性低、對天然木質(zhì)纖維素分解能力弱、生產(chǎn)周期長以及價格昂貴等問題，嚴重制約了其工業(yè)化應(yīng)用[1，2]。本實驗室選育的綠色木霉（Trichoderma viride）Sn-9106能以秸稈、紙漿等工業(yè)廢物為碳源，將其中的纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖成分，是一株適合固體發(fā)酵模式的纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)菌株[3-5]。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用分子生物學(xué)手段研究絲狀真菌纖維素酶系分泌機制、活性及協(xié)同作用等逐漸成為目前研究熱點[6-8]。研究表明，纖維素酶在大腸桿菌表達系統(tǒng)中容易形成包涵體、酶活性比較低、缺乏糖基化修飾；在酵母中表達又存在著過度糖基化和蛋白折疊等問題，使表達的纖維素酶活性嚴重喪失[9]。目前木霉為適合真菌類纖維素酶的表達載體之一[10]。瑞氏木霉（Trichoderma reesei）中外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）是纖維素酶基礎(chǔ)性表達基因之一。在異源表達過程中，cbhⅠ啟動子在沒有誘導(dǎo)物存在的情況下也能夠啟動報告基因表達[1]。本研究利用瑞氏木霉cbhⅠ啟動子、以綠色熒光蛋白為報告基因、潮霉素為抗性標(biāo)記構(gòu)建綠色木霉表達載體，為構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 瑞氏木霉QM9414、綠色木霉Sn-9106、pET30-GFP質(zhì)粒和pSK質(zhì)粒載體由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院保存；pSM565質(zhì)粒由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心提供；感受態(tài)細胞E. coli DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T Simple Vector購自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶、Long Taq DNA聚合酶等PCR試劑，質(zhì)粒小量提取試劑盒，DNA Marker，潮霉素，IPTG，X-Gal均購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 cbhⅠ啟動子、GFP基因、hph基因的克隆 根據(jù)GenBank NCBI上瑞氏木霉cbhⅠ啟動子、GFP基因及hph基因序列設(shè)計引物如表1。提取瑞氏木霉基因組DNA[11]，并以基因組DNA為模板，PCR擴增克隆出cbhⅠ啟動子。cbhⅠ啟動子用二步法進行PCR擴增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s ，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，67 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。分別以pET30-GFP和 pSM565質(zhì)粒為模板擴增出GFP基因、hph基因。GFP基因PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。hph基因PCR擴增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物回收后，與pMD 19-T Simple Vector連接，并送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.2.2 cbhⅠ啟動子表達載體pSK-cbhⅠ的構(gòu)建 將pMD 19-T-cbhⅠ用SacⅠ和EcoRⅠ雙酶切，然后與經(jīng)同樣酶切的pSK載體連接，得到重組質(zhì)粒pSK-cbhⅠ，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上隨機選取白色轉(zhuǎn)化子，小量提取制備轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒用于酶切鑒定。

1.2.3 表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的構(gòu)建 將pMD 19-T-GFP用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切，與同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pSK-cbhⅠ連接，得重組質(zhì)粒后，再以同樣的方法將pMD 19-T-hph進行酶切和連接，構(gòu)建表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph。

1.2.4 綠色木霉表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的轉(zhuǎn)化 綠色木霉Sn-9106原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化參照文獻[12]。將適量轉(zhuǎn)化液涂布于再生培養(yǎng)基， 28 ℃培養(yǎng)12～16 h；在再生培養(yǎng)基上添加一層含75 μg/mL潮霉素的半固體絲狀真菌MM培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3～4 d；挑選潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子，接種于PDA斜面培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d；挑取斜面培養(yǎng)基上的綠色木霉制成水壓片，在熒光顯微鏡下觀察菌絲，選取有熒光的綠色木霉接種于MM液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d；利用PCR方法檢測GFP基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 cbhⅠ啟動子、GFP基因和hph基因的克隆

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴增結(jié)果（圖1-圖3）。PCR產(chǎn)物電泳條帶清晰完整，cbhⅠ啟動子大小約為1 500 bp，GFP基因大小為726 bp，hph基因大小為1 026 bp，均與預(yù)期大小相符。測序后進行BLAST比對分析同源性分別達到96%、90%和92%。

2.2 綠色木霉表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的構(gòu)建

將pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達載體轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，在氨芐培養(yǎng)基上隨機選取白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切鑒定見圖4。酶切產(chǎn)物大小與cbhⅠ啟動子、GFP基因、hph基因片段大小相符。綠色木霉表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph圖譜如圖5所示。

2.3 pSK-cbhⅠ-GFP-hph轉(zhuǎn)化綠色木霉Sn-9106

將pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達載體轉(zhuǎn)化綠色木霉Sn-9106原生質(zhì)體中，在含75 μg/mL潮霉素的培養(yǎng)皿上得到16個抗性轉(zhuǎn)化子，利用表1中3對引物進行PCR檢測，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果（圖6）。由圖6可知，cbhⅠ啟動子、hph基因及GFP基因均已轉(zhuǎn)化到綠色木霉中。將轉(zhuǎn)化子單菌落經(jīng)PDA培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后，制成水壓片，在熒光顯微鏡下可觀察到含有綠色熒光的菌絲（圖7）。

3 小結(jié)

本研究利用pSK載體為骨架，構(gòu)建了帶有cbhⅠ啟動子的pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達載體，在熒光顯微鏡下觀察到含有綠色熒光的菌絲，證實綠色木霉外源基因表達載體構(gòu)建成功。雖然驗證了綠色熒光蛋白的表達，但對于cbhⅠ啟動子是否對外源基因啟動了高效表達還有待進一步研究。絲狀真菌纖維素酶表達系統(tǒng)表達出的酶為混合酶系，給分離純化目的蛋白造成很大的障礙，而且絲狀真菌纖維素酶啟動子為誘導(dǎo)型，所以在利用絲狀真菌作為纖維素酶表達宿主時，通常構(gòu)建組成型表達載體。另外也有文獻報道，以絲狀真菌啟動子構(gòu)建載體表達外源蛋白，須在外源蛋白基因前加入信號肽。因此，下一步對瑞氏木霉cbhⅠ啟動子的作用機制進行研究，并應(yīng)用于對綠色木霉纖維素酶基因的改造。

參考文獻：

[1] 謝天文，劉曉風(fēng)，袁月祥. 真菌產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物及其調(diào)控機理研究進展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2010，16（3）：440-444.

[2] ARANTES V， SADDLER J N. Access to cellulose limits the efficiency of enzymatic hydrolysis： The role of amorphogenesis[J]. Biotechnol Biofuels，2010，3（1）：1-11.

[3] 陳祖潔，曹淡君.我國第一條纖維素酶系列產(chǎn)品生產(chǎn)線的研制和建立[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993，24（S1）：1-3.

[4] 李淑榮，陳祖潔.Sn-9106纖維素酶性質(zhì)載體篩選及飼喂效果研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993，24（S1）：4-15.

[5] 劉 麗，任大明，曹淡君. 纖維素酶提高白酒出酒率的研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993，24（S1）：65-69.

[6] VANDEN W A， GASKELL J， MOZUCH M， et al. Transcriptome and secretome analyses of Phanerochaete chrysosporium reveal complex patterns of gene expression[J]. Appl Environ Microbiol，2009，75（12）：4058-4068.

[7] CHERRY J R. FIDANTSEF A L. Directed evolution of industrial enzymes： An update[J]. Curr Opin Biotechnol，2003，14（4）：438-443.

[8] CROM L S， SCHACKWITZ W， PENNACCHIO L， et al. Tracking the roots of cellulase hyperproduction by the fungus Trichoderma reesei using massively parallel DNA sequencing[J]. Proc Natl Acad Sci，2009，106（38）：16151-16156.

[9] PUNT P J，BIEZEN V N，CONESA A，et al. Filamentous fungi as cell factories for heterologous protein production[J]. Trends in Biotechnology，2002，20（5）：256-263.

[10] HOMBERGH P T W D， VONDERVOORT P J V D，F(xiàn)RAISSINET-TACHET L，et al. Aspergillus as a host for heterologous protein production：The problem of proteases[J].Trends in Biotechnology，1997，15（7）：256-263.

[11] 吳志紅，汪天虹，黃 衛(wèi)，等. 簡便易行的絲狀真菌染色體DNA提取法[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（4）：575-577.

[12] PENTTIL M， NEVALAINEN H， R？魧TT？魻 M， et al. A versatile transfornation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei[J]. Gene，1987，61（2）：155-164.