摘要：根據(jù)玉米（Zea mays）ZmbZIP的基因序列和植物表達載體pCAMBIA3301的多克隆位點設計帶有限制性內(nèi)切酶位點的特異性引物，以質(zhì)粒pGM-T-ZmbZIP為模板PCR擴增ZmbZIP基因片段，雙酶切目的片段及載體，回收后連接，構建該基因的植物表達載體。結(jié)果表明，擴增出的ZmbZIP基因片段長度為894 bp。經(jīng)PCR檢測及測序鑒定，表明植物表達載體構建成功，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：植物表達載體；玉米（Zea mays）；ZmbZIP

中圖分類號：S515；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3175-03

植物堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper， bZIP）蛋白是一個大的轉(zhuǎn)錄因子家族，它的成員參與調(diào)控逆境應答和激素信號轉(zhuǎn)導[1-3]。堿性亮氨酸拉鏈蛋白包含一個堿性DNA結(jié)合區(qū)域和一個亮氨酸拉鏈二聚基序。根據(jù)植物中bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構差異，可將bZIP轉(zhuǎn)錄因子分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S亞族共10個亞族。研究表明轉(zhuǎn)基因植物過表達A族bZIP基因可增強植物對非生物脅迫的忍耐。例如擬南芥AREB1/ABF2是葡萄糖信號傳遞中的重要元件，它的過表達影響擬南芥對多種逆境的忍耐[4，5]，過表達ABF3或AREB2/ABF4可提高轉(zhuǎn)基因植物對干旱的忍耐能力[6]。在水稻中，OsbZIP72是ABA信號轉(zhuǎn)導的正調(diào)控子，過表達OsbZIP72增強水稻苗期的抗旱能力[7]。

玉米（Zea mays）是重要的糧食和飼料作物，它的生長發(fā)育受多種非生物逆境的嚴重影響[8]，因此揭示玉米非生物逆境應答的分子機制是非常重要的。利用模式植物擬南芥研究基因的功能是目前廣泛采用的方法，而構建植物表達載體是在植物體內(nèi)研究基因功能的前提。因此，本研究構建了玉米ZmbZIP基因的植物表達載體，經(jīng)菌液PCR和測序鑒定所構建載體的正確性，為進一步轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥研究基因的功能奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶、大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10購于天根生化科技（北京）有限公司。各種限制性內(nèi)切酶購于寶生物工程（大連）有限公司。引物合成及序列測定由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司完成。含有ZmbZIP基因cDNA序列的pGM-T-ZmbZIP菌液和植物表達載體pCAMBIA3301菌液由新鄉(xiāng)學院生命科學與技術系園林教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 根據(jù)ZmbZIP基因cDNA序列和pCAMBIA3301的多克隆位點設計一對引物，上游引物添加Nco Ⅰ酶切位點，下游引物添加Bgl Ⅱ酶切位點，引物序列為：F，5′-ATACCATGGATGGACGAG

CTGCTCCAGAGC-3′； R，5′-TAAAGATCTTCACCA

GGGGGCCGTCAACGT-3′ （下劃線分別表示NcoⅠ 和Bgl Ⅱ酶切位點）。按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pGM-T-ZmbZIP質(zhì)粒。以pGM-T-ZmbZIP質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。PCR反應體系包括質(zhì)粒（50 ng/μL） 1 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 2 μL、引物（10 μmol/L） 2 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，補ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）觀察結(jié)果，采用凝膠回收試劑盒回收長度正確的擴增片段產(chǎn)物。

1.2.2 植物表達載體的構建 按TaKaRa限制性內(nèi)切酶使用說明書推薦體系，用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切ZmbZIP回收產(chǎn)物和植物表達載體pCAMBIA3301，酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接目的片段到植物表達載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，涂于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆，經(jīng)含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h后，菌液PCR檢測是否有插入片段，陽性克隆送北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmbZIP基因片段的PCR擴增

以含有ZmbZIP基因cDNA序列的質(zhì)粒pGM-T-ZmbZIP為模板，PCR擴增帶有Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位點的產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物大小為894 bp，與預期大小一致（圖1），且產(chǎn)物條帶清晰明亮，滿足后續(xù)實驗的要求。

2.2 植物表達載體的構建及鑒定

用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切目的片段和載體后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，對重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmbZIP進行菌液PCR鑒定，結(jié)果表明，能夠從轉(zhuǎn)化pCAMBIA3301-ZmbZIP的大腸桿菌菌液中擴增出大小為894 bp的目的片段，陽性菌液送北京鼎國昌盛公司測序，測序比對發(fā)現(xiàn)，插入序列與ZmbZIP序列完全一致，表明pCAMBIA3301-ZmbZIP載體構建成功（圖2）。

3 討論

玉米中存在170個堿性亮氨酸拉鏈蛋白，但是僅有很少的玉米堿性亮氨酸拉鏈蛋白的功能被研究[9，10]。本研究成功構建了玉米ZmbZIP基因的植物表達載體并采用菌液PCR結(jié)合測序的方法對構建的植物表達載體進行了鑒定，與酶切鑒定相比，測序鑒定能夠保證插入片段序列的正確性，只有未發(fā)生堿基突變的序列才能在植物體內(nèi)編碼正確的堿性亮氨酸拉鏈蛋白，行使其生物學功能。本研究通過測序驗證了插入的ZmbZIP序列與原始序列一致，為進一步轉(zhuǎn)化擬南芥揭示ZmbZIP基因的功能奠定了實驗基礎。

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