摘要：將BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡（Artificiai neural network）技術與傳統(tǒng)的正交試驗方法相結合，提出一種新的試驗分析和處理方法，利用神經(jīng)網(wǎng)絡特有的自學能力，對主要影響因素進行仿真優(yōu)化，獲得Bacillus velezensis Z-27菌株培養(yǎng)基組分，即玉米粉2.0%、豆餅粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%，起始pH為7.0、接種量為2.0%，應用優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組分進行驗證試驗，取得了較好的效果。

關鍵詞：BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡（Artificiai neural network）；正交試驗；培養(yǎng)基；Bacillus velezensis Z-27菌株

中圖分類號：Q936 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3109-03

近年來，健康和生態(tài)環(huán)境問題日益受到重視，中國已全面啟動實施無毒、無公害的微生態(tài)飼料添加劑工程。農業(yè)部于1994年公布的可用于微生態(tài)制劑生產(chǎn)的菌種包括乳酸桿菌、芽孢桿菌、糞鏈球菌、酵母菌和雙歧桿菌。其中芽孢桿菌可以使腸道內形成有利于厭氧微生物生長的環(huán)境，從而保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡。芽孢桿菌在腸道中還可以產(chǎn)生多種消化酶和有機酸，這有益于提高飼料的利用率，抑制有害菌的繁殖，可為乳酸桿菌等菌群的生長創(chuàng)造有利條件。所以，芽孢桿菌是一種理想的動物微生態(tài)制劑的生產(chǎn)菌種。Z-27菌株[1]是以來自豬糞便的耐高濃度膽酸鹽的產(chǎn)芽孢菌株為出發(fā)菌株，以大腸桿菌為病原指示菌，經(jīng)過初篩、復篩篩選出的具有較高拮抗活性的芽孢桿菌，對其進行了菌種鑒定，經(jīng)鑒定為Bacillus velezensis。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡（Artificiai neural network），簡稱神經(jīng)網(wǎng)絡，是近幾年迅速發(fā)展起來的一門集神經(jīng)科學、信息科學、計算機科學于一體的交叉邊緣學科，是生物神經(jīng)網(wǎng)絡 （Biology neural network）在結構、功能及某些基本特性方面的理論抽象和模擬而構成的一種信息處理系統(tǒng)[2，3]。本研究以Bacillus velezensis Z-27為發(fā)酵菌株，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡結合正交試驗法優(yōu)化其培養(yǎng)基發(fā)酵條件，旨在降低生產(chǎn)成本，為進一步研制具有抗腹瀉功能的豬用益生菌制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Bacillus velezensis Z-27菌株，由河北農業(yè)大學生命科學學院實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，葡萄糖1.0%，NaH2PO4·2H2O 0.2%，Na2HPO4·2H2O 0.4%，CaCl2 0.02%，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗確定培養(yǎng)基組分 根據(jù)試驗需要單因素改變基礎培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽。搖床轉速170 r/min，搖瓶裝液量50 mL，接種10～12 h芽孢桿菌Z-27菌株種子液，接種量2.0%，37 ℃培養(yǎng)24 h?？疾靻我蛩貙ρ挎邨U菌Z-27菌株發(fā)酵液活菌濃度、發(fā)酵液抗菌活性及芽孢產(chǎn)率的影響，從而得到最佳碳源、氮源和無機鹽。

利用發(fā)酵液梯度稀釋后涂布平板的活菌計數(shù)法測定芽孢桿菌Z-27菌株搖瓶發(fā)酵液活菌濃度。芽孢觀察和計數(shù)采用孔雀綠芽孢染色和血球計數(shù)板直接計數(shù)相結合的方法，將培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)后在顯微鏡下觀察，計算芽孢產(chǎn)率。采用瓊脂打孔擴散法測定發(fā)酵液抗菌活性。

1.3.2 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基組成及接種量等培養(yǎng)條件對芽孢桿菌Z-27菌株發(fā)酵的影響按正交試驗表L16（45）進行考察[4-8]。碳源采用1.0%、2.0%、3.0%、4.0%四個水平；氮源采用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%四個水平；無機鹽采用0.01%、0.03%、0.05%、0.07%四個水平；pH采用6.5、7.0、7.5、8.0四個水平；接種量采用1.0%、2.0%、3.0%、4.0%四個水平。以發(fā)酵液活菌濃度為指標，確定出芽孢桿菌Z-27菌株最佳培養(yǎng)基組成及最適接種量[9，10]。

1.3.3 芽孢桿菌Z-27菌株生長曲線的測定 在組成優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種齡為10～12 h的芽孢桿菌Z-27菌株種子液，搖床轉速170 r/min，搖瓶裝液量50 mL，接種量2.0%，37 ℃培養(yǎng)24 h。每隔2 h測定1次發(fā)酵液OD600 nm值，記錄測定時間及相應OD600 nm值繪制芽孢桿菌Z-27菌株的生長曲線。

1.3.4 建立BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型 建立神經(jīng)網(wǎng)絡的圖形用戶界面：應用Matlab7.2的GUIDE功能創(chuàng)設了含有輸入因子數(shù)據(jù)庫、輸出因子數(shù)據(jù)庫、神經(jīng)網(wǎng)絡訓練參數(shù)設置、隱含層數(shù)、隱含層的神經(jīng)元數(shù)、訓練函數(shù)、預測輸入、預測結果、神經(jīng)網(wǎng)絡保存等多個功能的操作界面。

數(shù)據(jù)輸入及網(wǎng)絡初始化：導入玉米粉、豆餅粉、MnSO4·H2O、pH、接種量5因素4水平的16個試驗值作樣本輸入，用專家相應評價結果作為輸入樣本對應的教師值，取精度ε=0.000 07，輸入節(jié)點數(shù)為5，隱含層取5個節(jié)點，輸出層取1個節(jié)點，以玉米粉、豆餅粉、MnSO4·H2O、pH、接種量 5因素為自變量，建立輸入矩陣，以活菌濃度為因變量，建立輸出矩陣，對數(shù)據(jù)網(wǎng)絡初始化。

網(wǎng)絡設置的訓練參數(shù)為：最大訓練步數(shù)為10 000，學習效率為0.02，訓練誤差目標為0，動量常數(shù)為0.05，網(wǎng)絡訓練采用Levebberg-Marquardt算法。

2 結果與分析

2.1 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.1.1 不同碳源對芽孢桿菌Z-27菌株搖瓶發(fā)酵的影響 在搖瓶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中分別加入1.0%的不同碳源，進行發(fā)酵試驗，結果見表1。由表1可見，在培養(yǎng)基中以玉米粉和麩皮為碳源，活菌濃度均≥2.6×109 CFU/mL，芽孢產(chǎn)率亦均≥90%，發(fā)酵液中抑菌物對大腸桿菌的抑菌活性也較高。其中以玉米粉為碳源時，相應的3個指標均表現(xiàn)為最高，故選擇玉米粉為最佳碳源。

2.1.2 不同氮源對芽孢桿菌Z-27菌株搖瓶發(fā)酵的影響 以1.0%玉米粉為碳源，在搖瓶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中分別加入1.0%的不同氮源進行發(fā)酵試驗，結果見表2。由表2可見，在培養(yǎng)基中以豆餅粉或花生餅粉為氮源，活菌濃度均≥2.40×109 CFU/mL，芽孢產(chǎn)率均≥97%，發(fā)酵液中抑菌物的活性也較高，因此豆餅粉或花生餅粉均可作為最佳氮源。以下試驗均選擇以豆餅粉為氮源。

2.1.3 不同無機鹽對芽孢桿菌Z-27菌株搖瓶發(fā)酵的影響 在搖瓶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中以1.0%玉米粉為碳源，以1.0%豆餅粉為氮源，分別添加FeSO4、ZnSO4、CuSO4·5H2O、CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 6種無機鹽代替培養(yǎng)基中的CaCl2，添加量均為0.02%，考察不同無機離子對發(fā)酵的影響，不同無機離子對芽孢桿菌Z-27菌株活菌數(shù)、芽孢產(chǎn)率和抑制大腸桿菌能力的影響結果見表3。由表3可見，Mn2+對芽孢桿菌Z-27菌株的促進作用最強，故選擇MnSO4·H2O作為無機鹽。

2.1.4 正交試驗與結果 綜合以上各單因素試驗結果，選擇玉米粉、豆餅粉、MnSO4·H2O、pH、接種量 5個因素，按正交試驗表L16（45）設計試驗（表4），結果見表5。

依據(jù)正交試驗的直觀分析結果，極差值大小為R豆餅粉>RpH>R玉米粉>R接種量>R■，表明豆餅粉為主要影響因素，pH影響次之。由表5可見，7號試驗組合發(fā)酵液的活菌數(shù)最高，為1.70×109 CFU/mL，其組合為A2B3C4D1E2，即玉米粉2.0%、豆餅粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%，起始pH為6.5，接種量為2.0%。

2.2 對主要因素進行仿真和優(yōu)化分析

在正交試驗所獲得的較優(yōu)組合的基礎上，改變一種影響因素值，固定其他4種影響因素值，應用所建立的BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型進行模擬，結果如圖1至圖5所示。

由圖1至圖5可知，固定其他4種影響因素值，改變一種影響因素值，所建立的BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型進行數(shù)值仿真，確定獲得Bacillus velezensis Z-27菌株培養(yǎng)基組分為：玉米粉2.0%、豆餅粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%、起始pH為7.0、接種量為2.0%。應用優(yōu)化得到的最佳組分進行了3次驗證試驗，所得活菌濃度平均為1.81×109 CFU/mL，優(yōu)于正交試驗結果。

3 小結與討論

1）利用正交試驗數(shù)據(jù)對BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型進行訓練，測試樣本的網(wǎng)絡預測值和實際測量值的相對誤差小于1%，訓練好的模型可對提取結果進行預測。

2）將BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡技術與傳統(tǒng)的正交試驗方法相結合，充分利用正交試驗數(shù)據(jù)，并對主要影響因素進行仿真優(yōu)化，獲得Bacillus velezensis Z-27菌株培養(yǎng)基組分：即玉米粉2.0%，豆餅粉1.5%，MnSO4·H2O 0.07%，起始pH為7.0，接種量為2.0%。

參考文獻：

[1] 王世英. 豬源抗腹瀉芽孢益生菌的分離與Z-27菌株的鑒定[J]. 湖北農業(yè)科學，2009，48（5）： 1200-1203.

[2] 沈 波，王李仁，許旭艷，等.應用BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型預測福州市山區(qū)細菌性痢疾流行[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2011，38（3）：423-424， 429.

[3] 郝中華.BP神經(jīng)網(wǎng)絡的非線性思想[J].洛陽師范學院學報，2008（4）：51-55.

[4] 區(qū)偉佳. 基于二次正交旋轉回歸優(yōu)化大豆內拮抗菌AF-67發(fā)酵工藝[J].生物數(shù)學學報，2010，25（4）：707-712.

[5] 范會蘭.抗犢牛腹瀉益生菌株 BN-9 產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J]. 湖北農業(yè)科學，2009，48（2）：405-409.

[6] 范會蘭.抗犢牛腹瀉益生菌株的篩選及其產(chǎn)芽孢和產(chǎn)抗菌蛋白條件優(yōu)化[D].成都：四川師范大學，2009.

[7] 蔡 云，張靖妤.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡優(yōu)化算法的工業(yè)企業(yè)經(jīng)濟效益評估[J].統(tǒng)計與決策，2012，358（10）：63-65.

[8] 褚以文.微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法及其 OPTI 優(yōu)化軟件[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），1999（2）：58-66.

[9] 王 煥.1株雞腸源益生芽孢桿菌的分離鑒定及其耐受特性研究[J].安徽農業(yè)科學，2008，36（33）：14426-14430.

[10] 景曉忠，嚴 紅.人工神經(jīng)網(wǎng)絡優(yōu)化發(fā)酵過程中氨氣釋放條件[J].安徽農業(yè)科學，2011，39（34）：21278-21279.