摘要：以羽衣甘藍(lán)（Brassica oleracea var. acephala）兩個自交系（F6代）作比較，利用ISSR標(biāo)記技術(shù)檢測了羽衣甘藍(lán)3個DH1代株系的遺傳穩(wěn)定性，并對5個群體進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，3個DH1代株系DN31、DP70、DT2和兩個自交系B62、B111利用9條ISSR引物分別擴(kuò)增出55、51、50、54和51條清晰條帶，其中，多態(tài)性位點DN31有3個，DP70有2個，DT2沒有，B62有19個，B111有15個。羽衣甘藍(lán)DH1代株系內(nèi)基本不存在遺傳差異，基因型是純合的，兩個自交系遺傳穩(wěn)定性相對較差。表明小孢子培養(yǎng)技術(shù)在獲得純合體材料上比人工自交的方法高效、快捷，而且獲得的純系基因型更純、更穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：羽衣甘藍(lán)（Brassica oleracea var. acephala）；DH系；ISSR標(biāo)記；遺傳穩(wěn)定性；聚類分析

中圖分類號：S635.9；S503 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3056-03

利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)能快速獲得育種急需的遺傳穩(wěn)定材料和培育新的種質(zhì)資源，提高育種效率。小孢子培養(yǎng)所得植株加倍后獲得的雙單倍體構(gòu)成的群體稱為DH群體，從DH群體中篩選出來的株系叫DH系，DH系在遺傳上是完全純合的，可以直接作為優(yōu)良親本用于品種改良[1]。科研工作者采用小孢子培養(yǎng)技術(shù)已獲得一系列作物的優(yōu)良品系[2-4]。ISSR分子標(biāo)記具有DNA樣品用量少、操作簡單、信息量大、多態(tài)性高等優(yōu)點，且由于引物更長，退火溫度更高因而具有更好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性[5]，是分析種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有效工具。很多研究均成功地利用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析植物的遺傳變異性和遺傳關(guān)系[6-8]。

羽衣甘藍(lán)（Brassica oleracea var. acephala）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）甘藍(lán)種的一個變種，二年生草本植物，觀葉為主，由于耐寒性強(qiáng)，觀賞期長，已成為我國廣大地區(qū)冬季及早春時節(jié)應(yīng)用最廣泛的觀賞植物之一[9]。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)開展羽衣甘藍(lán)育種工作，能快速獲得育種急需的遺傳穩(wěn)定材料，提高育種效率。小孢子植株DH系基因型理論上是完全純合的，而通過多代自交也可以達(dá)到此目的。為了比較小孢子培養(yǎng)技術(shù)和人工自交分別獲得純合體材料的效率，試驗以羽衣甘藍(lán)兩個自交系作比較，利用ISSR標(biāo)記技術(shù)檢測了羽衣甘藍(lán)3個基因型DH1代株系的遺傳穩(wěn)定性，并對5個株系進(jìn)行了聚類分析。

1 材料與方法

1.1 材料

羽衣甘藍(lán)3個基因型名古屋-紅、P3、東京-白的DH1代DN31、DP70和DT2，名古屋-紅和“K12”的自交系B62（F6代）和B111（F6代），材料來源及主要特征見表1。由羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)獲得的植株稱為DH0代，經(jīng)DH0代自交的自交一代稱為DH1代。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 分別從供試材料各單株上取幼嫩葉片，參照王灝等[10]的方法，用稍作改良的CTAB小量法提取基因組DNA。

1.2.2 ISSR擴(kuò)增 ISSR引物自行設(shè)計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL，其中10×Buffer 2 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶1 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 20 ng。 擴(kuò)增反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸90 s，接著梯度降溫進(jìn)行復(fù)性，5個循環(huán)后穩(wěn)定在53 ℃復(fù)性，進(jìn)行38個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠（TAE電泳緩沖液，0.5 μg/L溴化乙錠）電泳檢測。在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照鑒定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 ISSR電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶，有帶記為1，無帶記為0。對原始矩陣用SimQual程序求Jaccard相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣。利用PopGene 32軟件計算擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性位點數(shù)（the number of polymorphic loci，N）、多態(tài)性位點比率（the percentage of polymorphic loci，P）、Shannon多樣性指數(shù)。用NTSYS-pc 2.10e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將由“1”和“0”生成的原始矩陣用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，最后通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羽衣甘藍(lán)DH1代株系ISSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

從38個ISSR引物中選取9個能夠獲得清晰條帶、反應(yīng)穩(wěn)定的ISSR引物（表2）。DN31、DP70、DT2每個株系各選取8株進(jìn)行ISSR標(biāo)記分析，結(jié)果表明，這3個DH1代株系9條ISSR引物分別擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定性好的條帶55、51和50條（圖1），大小在200～1 500 bp，其中多態(tài)性位點DN31為3個，DP70為2個，DT2沒有，每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在3～8條；3種材料的多態(tài)性位點比率分別為5.45%、3.92%和0，平均多樣性指數(shù)（I）分別為0.033 7、0.094 0和0 （表3），其中DT2沒有多態(tài)性位點，說明它的各株系間完全沒有差異；從多態(tài)性位點比率和多樣性指數(shù)上可以看出，羽衣甘藍(lán)3個材料DH1代株系間基本無遺傳差異，說明由小孢子培養(yǎng)所得的植株經(jīng)過自交后的DH1代各株系基因型是純合的。

同時也對兩個經(jīng)過6代自交的自交系材料（B62、B111）進(jìn)行了ISSR分析，結(jié)果表明，B62和B111的多態(tài)性位點比率分別為35.19%和29.41%，平均多樣性指數(shù)（I）分別為0.183 6和0.167 1（表3）。經(jīng)過6代自交的材料在遺傳上還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到純合，說明通過小孢子培養(yǎng)獲得純系相對于人工自交來說，不僅縮短了育種時間，也提高了效率，能在1～2年內(nèi)就獲得遺傳穩(wěn)定的純系。

2.2 DH1代株系ISSR聚類分析

對羽衣甘藍(lán)3個DH1代株系和2個自交系ISSR結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，DH1代株系DN31、DP70、DT2的各株系間相似系數(shù)分別為0.97～1.00、0.98～1.00和1.00，說明這3個株系在遺傳上極其相似，表明它們在遺傳上是純合的，DN31、DP70株系內(nèi)略存在一些變異，這可能是自交過程中出現(xiàn)的稍許變異，在正常變異范圍內(nèi)。而兩個自交系B62和B111的相似系數(shù)范圍則相對大許多，分別為0.82～0.98和0.83～0.94，說明這兩個自交系內(nèi)各單株還存在一定程度的遺傳差異，基因型還沒有達(dá)到純合。再一次驗證了DH1代比F6代自交系純合度高。

3 小結(jié)與討論

小孢子植株DH1代理論上其基因型是完全純合的，即DH1代株系內(nèi)各單株之間在遺傳組成上完全相同，不存在差異。通過ISSR標(biāo)記分析了羽衣甘藍(lán)3個DH1代株系內(nèi)的遺傳多樣性，并以F6代自交系作為對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個DH1代株系內(nèi)的遺傳多樣性都極小，其相似系數(shù)均接近于1，其中DH1代株系DT2各單株間完全沒有差異，遺傳相似系數(shù)為1.0；在DH1代株系DN31和DP70中存在較小的差異，可能是由于ISSR分析過程中存在某些誤差，或者是種植于大田中受到環(huán)境因素的影響發(fā)生的稍許變異。總體來講，羽衣甘藍(lán)的DH1代株系內(nèi)基本不存在遺傳差異，基因型是純合的。被試的兩個自交系的遺傳多樣性則相對大得多，說明自交6代的自交系其在遺傳上遠(yuǎn)未達(dá)到純合，因此羽衣甘藍(lán)要想通過人工自交的手段獲得純系，自交6代還遠(yuǎn)不夠，估計至少要自交8～10代。這也證實了小孢子培養(yǎng)技術(shù)在獲得純合體材料上比人工自交的方法更高效、快捷，而且獲得的純系在基因型上更純、更穩(wěn)定。

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