摘要：非典型分支桿菌與結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）復(fù)合群、麻風(fēng)分支桿菌（M. leprae）同屬于分支桿菌屬（Mycobacterium）。隨著對結(jié)核桿菌的深入研究，非典型分支桿菌也逐漸引起了人們的關(guān)注。為了對非典型分支桿菌進行系統(tǒng)的了解和分類鑒定，就國內(nèi)外常用的分類鑒定方法進行了綜述。

關(guān)鍵詞：非典型分支桿菌；結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）；分類；鑒定

中圖分類號：R378.91；C34 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-2977-03

非典型分支桿菌是指除了結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）復(fù)合群和麻風(fēng)分支桿菌（M. leprae）之外的其他分支桿菌，包括偶發(fā)分支桿菌（M. fortuitum）、鳥分支桿菌（M. avium）、堪薩斯分支桿菌（M. kanasii）等30多種分支桿菌。非典型分支桿菌生長緩慢，具有一定的致病性，臨床表征與結(jié)核分支桿菌相似，容易造成誤診。因此，對非典型分支桿菌的分類鑒定就顯得尤為重要。本研究擬對臨床中常用的分類鑒定方法進行綜述，旨在為更深入的研究提供參考。

1 傳統(tǒng)分類方法

培養(yǎng)分支桿菌常用的培養(yǎng)基有固體培養(yǎng)基，如改良羅氏培養(yǎng)基、匡氏瓊脂PNB培養(yǎng)基和Middle brook 7H10、7H11瓊脂培養(yǎng)基，在固體培養(yǎng)基中通過觀察菌落形態(tài)和生長情況鑒定分支桿菌；液體培養(yǎng)基包括Sauton培養(yǎng)基和Middle brook 7H9等，細菌充分接觸營養(yǎng)物質(zhì)時易大量獲得細菌，但缺點是易污染，需先進行涂片處理才能觀察菌落形態(tài)。2008年Wang等[1]檢查一位患者咽喉部病變時，經(jīng)過組織切片和涂片后觀察到侵染細菌與鳥分支桿菌復(fù)合群相一致。2010年Sajduda等[2]應(yīng)用PRA（PCR restriction analysis）和傳統(tǒng)分離方法鑒定64株分支桿菌，結(jié)果表明PRA優(yōu)于傳統(tǒng)方法和特殊DNA測序方法。Guarin等[3]在研究區(qū)分龜亞科分支桿菌-膿腫分支桿菌復(fù)合群時，對傳統(tǒng)分類方法、高效液相色譜分析方法和實時PCR方法進行了比較試驗。由于傳統(tǒng)鑒定方法耗時長、對操作要求十分嚴格、培養(yǎng)物易受外界環(huán)境污染，所以在實際工作中不易被采用。高效液相色譜法雖然可被廣泛應(yīng)用于非結(jié)核性分支桿菌的分類鑒定，但是該方法不能將龜亞科分支桿菌-膿腫分支桿菌復(fù)合群里的成員區(qū)分開。相對前兩種方法，采用實時PCR方法更為快捷省時、操作簡單，大大提高了工作效率。

2 全自動分支桿菌快速生長培養(yǎng)儀檢測方法

20世紀70年代末，BD公司研制的BACTEC 460-TB成為全球第一臺專業(yè)的全自動分支桿菌培養(yǎng)鑒定儀，該系統(tǒng)培養(yǎng)基以Middle brook 7H12為基礎(chǔ)，在培養(yǎng)基中加入標記14C的棕櫚酸，因此也稱為放射性同位素液體培養(yǎng)法。張敦熔[4]在Middle brook系列培養(yǎng)基中加入NAP及其他選擇性抑制劑，將培養(yǎng)出來的細菌經(jīng)過分析儀檢測能夠快速鑒定出結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌，該技術(shù)解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法耗時費力的缺點，使細菌快速培養(yǎng)成為現(xiàn)實。Kontos等[5]應(yīng)用全自動分支桿菌快速生長培養(yǎng)儀BACTEC MGIT960和PCR-RFLP相結(jié)合的方法檢測從臨床樣本中分離到的分支桿菌，檢測結(jié)果與常規(guī)生化試驗檢測結(jié)果相一致，但在檢測的敏感性和時間上明顯優(yōu)于常規(guī)檢測方法。

3 噬菌體分析方法

胡忠義等[6]應(yīng)用分支桿菌噬菌體D29采用噬菌體生物擴增法鑒定結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌，經(jīng)過37 ℃感染1 h，結(jié)果結(jié)核分支桿菌生物擴增檢測為陽性，非結(jié)核分支桿菌檢測為陰性。呂斌等[7]應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建可表達熒光素酶的結(jié)核分支桿菌重組噬菌體。由于噬菌體具有特異性強、靈敏度高的特點，且不同的分支桿菌發(fā)光水平不同，因此重組噬菌體分析方法是一種鑒別結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌的有效方法。

4 聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域。由于PCR技術(shù)具有快速、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點，在分支桿菌鑒定方面也是一種常用的鑒定方法。李國利等[8]利用雙重PCR技術(shù)尋找結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌之間的特異性條帶，旨在快速鑒定結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌。侯瑞生等[9]利用多重PCR體系將臨床病例標本和標準菌株進行檢測比較，結(jié)果顯示對病例標本和標準菌株的檢測靈敏度達到94.6%，特異性達到100.0%。吳雪瓊等[10]利用不同細菌的單鏈DNA構(gòu)象不同的特點，建立了PCR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性聚合酶鏈式反應(yīng)體系，用以區(qū)別結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌。Yamada-Noda等[11]根據(jù)dnaJ基因建立PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明，在54株模式株中，dnaJ的同源性為80.4%，低于16S rRNA的96.6%、rpoB的91.3%和hsp65的91.1%，dnaJ PCR技術(shù)可以作為一種新的方法區(qū)別結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌，利用通用引物建立PCR反應(yīng)體系并進行測序分析可以準確地鑒定出多種分支桿菌。Selvaraju等[12]利用hsp65基因限制性分析龜亞科分支桿菌復(fù)合群，該方法根據(jù)hsp65基因的多態(tài)性可以將復(fù)合群里的每種菌株分別鑒定出來。Martin等[13]利用生化方法、hsp65基因PCR-RFLP和PRA技術(shù)鑒定從人類臨床標本中分離出分支桿菌，結(jié)果表明，相對一般生化方法，PRA技術(shù)操作簡單、方便、快捷，是一種可靠的鑒定方法。Sajduda等[14]應(yīng)用PRA配合毛細管電泳法，分離鑒定出27株堪薩斯分支桿菌和29株龜分支桿菌-膿腫分支桿菌復(fù)合群。結(jié)果表明，PRA技術(shù)配合毛細管電泳法能夠快速準確地鑒定分支桿菌。

5 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是將一段帶有標記的核酸片段在一定的溫度、pH等條件下與核酸互補鏈通過氫鍵結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，經(jīng)過顯影技術(shù)顯示結(jié)果。李國利等[15]以16 S-23 S rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列為靶基因設(shè)計核酸探針，利用PCR-反向雜交技術(shù)可以將分支桿菌鑒定到種的水平。還可以利用生物素標記臨床樣本的核酸制成探針，與標準菌株DNA雜交，以大腸桿菌作為陰性對照，可以快速將細菌鑒定到種。梁建琴等[16]運用16 S rRNA-寡核苷酸探針反向雜交陣列法檢測臨床樣本中的分支桿菌，結(jié)果顯示寡核苷酸探針特異性強、檢測靈敏度高，可作為鑒定臨床分支桿菌菌種的方法。Tobler等[17]采用hsp65實時PCR和DNA微陣列法快速檢測37株分支桿菌，結(jié)果鑒定出34株分支桿菌，與16 S rRNA的測序結(jié)果一致。Sun-Joon等[18]采用rpoB PCR-反向DNA寡核苷酸特異性探針鑒定分支桿菌，從504株臨床樣本中分離出48株鳥分支桿菌和60株胞內(nèi)分支桿菌，其他菌株經(jīng)鑒定分別為366株結(jié)核分支桿菌、9株膿腫分支桿菌、8株偶發(fā)分支桿菌、2株淺黃分支桿菌和11株外來分支桿菌。該方法快速、準確、敏感度高、特異性強。

6 細胞脂肪酸成分分析方法

將細菌制成凍干粉后，將粉末經(jīng)過甲酯化，供氣相色譜儀或色譜/質(zhì)譜儀（GC/MS）分析，由于非結(jié)核分支桿菌含有結(jié)核分支桿菌所沒有的特征脂肪酸，經(jīng)過儀器分析鑒定出異十六烷酸、異十七烷酸、十六烯酸、十八烯酸、十八二烯酸等成分，進一步探明了其組分的化學(xué)本質(zhì)，鑒定出戈登分支桿菌（M. gordonae）無結(jié)核分支桿菌硬脂酸，牛型結(jié)核分支桿菌（M. bovis）沒有α-甲基十八烯酸，為分支桿菌脂肪酸分析提供了科學(xué)依據(jù)。美國MIDI公司生產(chǎn)的全細胞脂肪酸分析系統(tǒng)，通過使用安捷倫的氣相色譜、MIDI微生物數(shù)據(jù)庫和MIDI圖譜識別軟件來鑒定每個菌株，對菌株的鑒定表現(xiàn)得更為客觀，減少了人為因素造成的錯誤，并能鑒定到種的水平。

7 氣相色譜法和薄層層析法

將氣相色譜法與傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定方法進行對比，結(jié)果兩種方法鑒定出的分支桿菌94.0%相符合。用氣相色譜法和薄層層析法相結(jié)合將28種標準菌株中85.0%的菌株區(qū)分開來。另外，Rebuffo-Scheer等[19]利用傅里葉變換紅外顯微分光鏡檢查法鑒別分支桿菌。利用紅外線光譜得到的線性反應(yīng)建立標準化模式，可以根據(jù)光譜分析快速檢測臨床標本的未知分支桿菌。

8 結(jié)語

臨床中用于鑒定非典型分支桿菌的方法很多，以上介紹的是國內(nèi)外較為常用的幾種分類鑒定方法。每種方法都有其優(yōu)缺點，因此，往往根據(jù)實際需要采用幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，如利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，再配合PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)進行鑒定，或者利用PCR技術(shù)與反向核酸探針技術(shù)相結(jié)合的方法，能夠更加系統(tǒng)、全面地對非典型分支桿菌進行分類鑒定，對臨床研究非典型分支桿菌有很大的幫助。

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