摘要：采用同源克隆法結(jié)合cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)克隆東北白樺（Betula platyphylla）咖啡酸/5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）基因COMT1，測序結(jié)果顯示東北白樺COMT1 cDNA序列全長

1 367 bp（GenBank登錄號：KC292201），其中完整編碼區(qū)長度1 095 bp，編碼365個氨基酸。利用Gateway技術(shù)分別構(gòu)建了東北白樺COMT1植物過量表達(dá)和反義表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：東北白樺（Betula platyphylla）；咖啡酸/5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）；克??；載體構(gòu)建

中圖分類號：S792.153 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3690-03

木質(zhì)素（Lignin）是酚類多聚體，其在植物體內(nèi)的含量僅次于纖維素[1，2]。因聚合前單體（香豆醇、松柏醇、芥子醇）不同，木質(zhì)素可分為紫丁香基木質(zhì)素（S型木質(zhì)素）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G型木質(zhì)素）和對-羥基苯基木質(zhì)素（H型木質(zhì)素）3種。裸子植物木質(zhì)素主要為G型，雙子葉植物主要含G型和S型木質(zhì)素，單子葉植物則含G型、S型和H型木質(zhì)素[3]。木質(zhì)素的生物合成分為3個階段：光合同化產(chǎn)物形成苯丙氨酸，苯丙氨酸代謝生成木質(zhì)素單體以及單體聚合形成不同類型的木質(zhì)素。木質(zhì)素單體合成途徑中存在多種代謝關(guān)鍵酶類，如苯丙氨酸氨解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL），阿魏酸-5-羥基化酶（Ferulate 5-hydroxylase，F(xiàn)5H），咖啡酸/5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Caffeic acid-O-methyltransferase，COMT），咖啡酰輔酶-A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Caffeoyl-CoAO-methyltransferase，CCoAOMT）和肉桂酰CoA還原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）等，該途徑也是目前木質(zhì)素調(diào)控研究的重點[4，5]。COMT催化咖啡酸、5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇甲基化分別生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，參與S型木質(zhì)素的合成，裸子植物中COMT只催化咖啡酸[6]。研究表明COMT是S型木質(zhì)素合成中的關(guān)鍵酶，而且與G型木質(zhì)素向S型木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[7]。此外，擬南芥comt突變體更容易被細(xì)菌和真菌所感染[8]，反義抑制COMT1與CCoAOMT表達(dá)均使轉(zhuǎn)基因煙草植株木質(zhì)素含量下降，且兩個基因同時被抑制時下降輻度更大[9，10]。

東北白樺（Betula platyphylla）是耐寒、喜光、耐貧瘠的樹種，具有生長快、適應(yīng)性強和用途廣泛等特點，是我國北方重要樹種之一[11]。然而東北白樺木材存在材性脆、韌性弱和密度較低等問題，對東北白樺材質(zhì)材性進(jìn)行遺傳改良是目前研究的熱點。本研究克隆東北白樺COMT1基因全長序列，構(gòu)建東北白樺COMT1基因植物過量表達(dá)和反義表達(dá)載體，以期為東北白樺材質(zhì)材性的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 pENTR/SD/D-TOPO和TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自Invitrogen公司，pMD18-T載體購自TaKaRa公司，pGWB2載體、DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)為東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室自制。

1.1.2 植物材料 3個月苗齡的東北白樺苗種植于東北林業(yè)大學(xué)實驗林場，采集幼嫩葉片用于植物總RNA的提取。

1.1.3 主要試劑 pBIOZOL購自博日科技有限公司，LA-Taq DNA聚合酶、DNA Marker、dNTP、RNA LA PCRTM Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒及3′-Full Race Kit購于TaKaRa公司，Silica Bead DNA Gel Extraction Kit購自Fermentas公司，質(zhì)粒小提試劑盒購于Promega公司，Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix購自Invitrogen公司，卡那霉素、潮霉素、慶大霉素、利福平購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 東北白樺總RNA的提取及cDNA的合成

將東北白樺材料在液氮中研磨至粉末，用小勺取0.1 g粉末至離心管中，采用pBIOZOL提取總RNA，具體操作步驟詳見其說明書，得到的總RNA用適量的無RNase水溶解，采用紫外分光光度計測定RNA濃度與純度。用RNA LA PCRTM Kit反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 東北白樺COMT1正義和反義片段的克隆

TGGTG-3′），以東北白樺總cDNA作模板，PCR擴增出東北白樺COMT1序列核心片段。采用cDNA末端快速擴增（Rapid Ampliphication of cDNA Ends，RACE）獲取COMT1全長序列，3′RACE擴增引物為D1，5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′；D2，5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTT-3′。具體操作按3′-Full Race Kit說明書進(jìn)行。

TTCCATGAT-3′。PCR擴增反應(yīng)體系為：2.0 μL 10×Buffer、上下游引物各0.5 μL、2.0 μL dNTPs、1.0 μL模板、0.5 μL Taq酶、13.5 μL H2O。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Silica Bead DNA Gel Extraction Kit回收、純化目的片段，連接pMD18-T載體，經(jīng)驗證為陽性后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 pGWB2植物表達(dá)載體的構(gòu)建 植物表達(dá)載體構(gòu)建采用Gateway技術(shù)，將PCR擴增得到的COMT1正義和反義片段回收純化后插入pENTR/SD/D-TOPO入門載體。經(jīng)DNA測序正確的質(zhì)粒與pGWB2采用Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix進(jìn)行LR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對陽性克隆進(jìn)行鑒定篩選。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 用DNASTAR軟件預(yù)測基因最長開放閱讀框及氨基酸序列，通過BLAST程序分析東北白樺與數(shù)據(jù)庫中已知物種的COMT1序列的同源性，用ClustalX軟件分析氨基酸序列一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北白樺COMT1完整編碼區(qū)cDNA序列的克隆

比對陸地棉、毛果楊、赤桉和歐洲白樺COMT基因同源序列的保守區(qū)后設(shè)計一對簡并引物（U1，U2），經(jīng)PCR擴增得到東北白樺COMT1保守區(qū)核心DNA片段。進(jìn)一步進(jìn)行東北白樺COMT1的3′RACE擴增，獲得含3′端的東北白樺COMT1序列852 bp。經(jīng)BLAST同源性比對表明，克隆得到的東北白樺COMT1基因序列與歐洲白樺COMT核酸相似度為99.5%。以報道的歐洲白樺COMT基因起始編碼區(qū)序列為上游引物，克隆得到的東北白樺COMT1基因終止編碼區(qū)為下游引物，PCR擴增得到長度約為1.1 kb的特異條帶（圖1），回收目的片段后測序，結(jié)果表明該序列長度為1 095 bp。加上該COMT1的3′端序列，克隆得到的東北白樺COMT1 cDNA序列全長為1 367 bp，將其上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為KC292201。

2.2 東北白樺COMT1完整編碼區(qū)cDNA序列分析

東北白樺COMT1開放讀碼框（Open reading frame）長度為1 095 bp（圖2），編碼365個氨基酸（圖3），同源性比對結(jié)果顯示東北白樺COMT1序列與陸地棉COMT（FJ479708）、毛果楊COMT（EU889124）、赤桉COMT（GU324973）以及歐洲白樺COMT（FJ667539.2）的同源性分別為79.2%、79.2%、77.2%和99.5%。

2.3 東北白樺COMT1植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用P1、P2引物擴增COMT1編碼區(qū)并將其與pENTR/SD/D-TOPO入門載體連接，得到重組質(zhì)粒pENTR/SD/D-TOPO-COMT1，利用LR反應(yīng)將該入門載體插入的COMT1片段交換到pGWB2植物過量表達(dá)載體上，得到pGWB2-COMT1植物過量表達(dá)載體。同理獲得COMT1反義植物表達(dá)載體pGWB2-antiCOMT1（圖4）。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，獲得其工程菌分別用于今后白樺COMT1基因過量表達(dá)和降低表達(dá)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灐?/p>

3 小結(jié)與討論

白樺是東北地區(qū)重要的造林樹種，由于東北白樺木材材性脆、韌性和密度較弱，通過基因工程手段調(diào)控木質(zhì)素代謝途徑是改良東北白樺材質(zhì)與材性的有效途徑之一[12]。近幾年白樺基因工程相關(guān)研究零星地出現(xiàn)在一些報道中，如白樺果膠甲酯酶抑制劑（PMEI）可調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變化，實現(xiàn)對細(xì)胞生長的調(diào)控[13]；白樺苯丙氨酸解氨酶（PAL）對于其抵抗病原菌過程起著重要作用，并且其酶活力與抗病性正相關(guān)[14]；劉雪梅等[15]分離了白樺木質(zhì)素生物合成相關(guān)酶CCoAOMT和4CL基因，并將其轉(zhuǎn)入煙草探討其調(diào)控?zé)煵菽举|(zhì)素合成的功能。COMT是S型木質(zhì)素合成中的關(guān)鍵酶，并且與G型木質(zhì)素向S型木質(zhì)素的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。本研究克隆了東北白樺COMT1基因的全長編碼區(qū)序列，登錄在GenBank數(shù)據(jù)庫中，并構(gòu)建了東北白樺COMT1的植物過量表達(dá)載體和反義表達(dá)載體，將其導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中。下一步工作將開展東北白樺木質(zhì)素合成代謝的遺傳調(diào)控研究，為今后東北白樺材質(zhì)與材性的改良奠定基礎(chǔ)。

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