摘要：采用醋酸菌（Acetobacter sp.）發(fā)酵生產(chǎn)醋酸，考察了靜置發(fā)酵、搖床發(fā)酵和循環(huán)噴淋發(fā)酵3種發(fā)酵方式對發(fā)酵速度和醋酸產(chǎn)量的影響，設(shè)計單因素試驗和正交試驗優(yōu)化循環(huán)噴淋發(fā)酵的工藝條件。結(jié)果表明，與靜置發(fā)酵和搖床發(fā)酵相比，循環(huán)噴淋發(fā)酵可以有效縮短發(fā)酵時間，提高醋酸產(chǎn)量。優(yōu)化的循環(huán)噴淋發(fā)酵條件為玉米芯作菌床載體、發(fā)酵時間24 h、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵液流速2.7 L/min、接種量75 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%，醋酸產(chǎn)量可達(dá)1.93 g/100 mL。

關(guān)鍵詞：醋酸；發(fā)酵條件；循環(huán)噴淋發(fā)酵；優(yōu)化

中圖分類號：TS264.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3650-04

食醋作為一種常見的富含營養(yǎng)的酸性調(diào)味品不僅具有調(diào)味效果，而且具有抑菌、美容、保健等多種功效[1]，醋酸生產(chǎn)一般采用醋酸菌液態(tài)發(fā)酵法[2]，近年來興起了一種新型的速釀法制醋工藝——循環(huán)噴淋工藝[3]，此工藝中的菌床載體不僅可提高發(fā)酵效率，而且能夠重復(fù)使用降低生產(chǎn)成本[4]。本研究分別采用不同的發(fā)酵工藝制備醋酸，并考察循環(huán)噴淋工藝中菌床載體、液體培養(yǎng)基中乙醇體積分?jǐn)?shù)、醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵液流速等因素對醋酸產(chǎn)量的影響，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，以期為工業(yè)生產(chǎn)上提高醋酸生產(chǎn)效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

醋酸菌（Acetobacter sp.）菌種AS1.41購自廣東省微生物菌種保藏中心；試驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純（AR）。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體培養(yǎng)基的制備[5] 酵母粉10 g/L、硫酸鎂2 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L溶解于無菌水中，pH自然，滅菌后加入發(fā)酵液體積2%的無水乙醇。

1.2.2 不同方式對醋酸發(fā)酵的影響 分別采用靜置發(fā)酵、搖床發(fā)酵和循環(huán)噴淋發(fā)酵（無菌床）3種方式制備醋酸，培養(yǎng)條件為液體培養(yǎng)基裝液量4 L、醋酸菌接種量50 g/L、發(fā)酵溫度30 ℃。其中循環(huán)噴淋發(fā)酵液的循環(huán)流速為2.2 L/min。每種發(fā)酵方式設(shè)置3次重復(fù)，每隔12 h采用酸堿滴定法測定發(fā)酵液中醋酸的含量，醋酸產(chǎn)量以每100 mL發(fā)酵液中醋酸的含量計[6，7]。

1.2.3 單因素試驗優(yōu)化循環(huán)發(fā)酵工藝 循環(huán)噴淋發(fā)酵裝置見圖1，罐高與直徑之比為15∶13，設(shè)置單因素試驗考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵液流速對醋酸產(chǎn)量的影響。①菌床載體。分別將100 g無菌的玉米芯、刨花、稻殼、蘆葦稈碎料置于發(fā)酵罐的菌床上，發(fā)酵溫度32 ℃、接種量35 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%、發(fā)酵液循環(huán)噴淋流速2.2 L/min，每隔12 h測定醋酸產(chǎn)量[8]。②乙醇體積分?jǐn)?shù)。菌床載體為玉米芯、發(fā)酵溫度32 ℃、接種量35 g/L、發(fā)酵液循環(huán)噴淋流速2.2 L/min、發(fā)酵時間24 h，發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%。③接種量。菌床載體為玉米芯、發(fā)酵溫度32 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%、發(fā)酵液循環(huán)噴淋流速2.2 L/min、發(fā)酵時間24 h，接種量分別為15、35、55、75、95 g/L；④發(fā)酵溫度。菌床載體為玉米芯、接種量35 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%、發(fā)酵液循環(huán)噴淋流速2.2 L/min、發(fā)酵時間24 h，發(fā)酵溫度分別為24、28、32、36、40 ℃；⑤發(fā)酵液流速。菌床載體為玉米芯、發(fā)酵溫度32 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%、接種量35 g/L、發(fā)酵時間24 h，發(fā)酵液流速分別為0.9、2.7、4.5、6.3、8.1 L/min。

1.2.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)、接種量和發(fā)酵液流速對醋酸產(chǎn)量的影響，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，因素與水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵方式對醋酸產(chǎn)量的影響

不同發(fā)酵方式下醋酸產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的變化見圖2。由圖2可知，發(fā)酵初期，由于發(fā)酵液中醋酸菌含量較低，因此發(fā)酵產(chǎn)醋酸的速度比較慢；到發(fā)酵中期，由于發(fā)酵液中醋酸菌大量繁殖且溶氧充足，發(fā)酵乙醇產(chǎn)醋酸的速度加快，醋酸產(chǎn)量迅速提高；到發(fā)酵后期，由于發(fā)酵液中的乙醇被消耗完全，醋酸產(chǎn)量不再升高。采用靜置發(fā)酵方式，發(fā)酵體系中的溶氧量會隨著發(fā)酵的進行逐漸被消耗，不能及時得到補充，因此醋酸產(chǎn)量上升較慢，發(fā)酵48 h后醋酸產(chǎn)量最高，之后隨發(fā)酵時間的延長醋酸產(chǎn)量基本保持不變。采用搖床發(fā)酵方式，發(fā)酵體系中的溶氧量能得到一定的補充，因此醋酸產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長上升速度較快，發(fā)酵36 h后醋酸產(chǎn)量即達(dá)到最大值，但醋酸屬于易揮發(fā)物質(zhì)，反應(yīng)體系的振動導(dǎo)致發(fā)酵生成的醋酸較易揮發(fā)，從而醋酸產(chǎn)量又不斷降低。而循環(huán)噴淋發(fā)酵因發(fā)酵液與罐體內(nèi)氧氣充分接觸使得發(fā)酵體系中的溶氧量充足，發(fā)酵速率隨發(fā)酵時間的延長迅速升高，發(fā)酵24 h醋酸產(chǎn)量即達(dá)到最大（1.159 g/100 mL），但之后由于發(fā)酵液和空氣充分接觸，產(chǎn)生的醋酸不斷揮發(fā)，醋酸含量又迅速下降。綜合考慮，循環(huán)噴淋發(fā)酵可以提高醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)醋酸的速度，大大縮短發(fā)酵時間，但發(fā)酵時間過長易造成產(chǎn)生的醋酸揮發(fā)損失，因此操作時應(yīng)注意嚴(yán)格控制發(fā)酵時間。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 菌床載體對循環(huán)噴淋發(fā)酵醋酸產(chǎn)量的影響 菌床載體對循環(huán)噴淋發(fā)酵工藝中醋酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，以玉米芯為發(fā)酵載體，發(fā)酵24 h就達(dá)到最大醋酸產(chǎn)量（1.679 g/100 mL），產(chǎn)酸速率明顯高于刨花、稻殼和蘆葦稈載體，最大醋酸產(chǎn)量顯著高于稻殼和蘆葦稈，且發(fā)酵后期醋酸產(chǎn)量的下降趨勢也較為平緩，因此后續(xù)試驗選擇玉米芯作為菌床載體。

2.2.2 發(fā)酵溫度對醋酸產(chǎn)量的影響 發(fā)酵溫度對醋酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，醋酸產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，發(fā)酵溫度為36 ℃時醋酸產(chǎn)量最高，為1.600 g/100 mL。溫度過低會導(dǎo)致醋酸菌的活性降低，從而醋酸產(chǎn)量較低，但溫度過高抑制醋酸菌生長[8]，同時會導(dǎo)致發(fā)酵罐里乙醇氧化時放出的熱量不能及時排出，不利于反應(yīng)向正方向進行，從而降低了醋酸產(chǎn)量。因此選擇32～36 ℃為適宜的發(fā)酵溫度范圍。

2.2.3 發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)對醋酸產(chǎn)量的影響 發(fā)酵液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)對醋酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，醋酸產(chǎn)量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高呈先升高后下降的變化趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%時醋酸菌發(fā)酵最旺盛，醋酸產(chǎn)量達(dá)1.695 g/100 mL。乙醇體積分?jǐn)?shù)過低，可被醋酸菌消耗的能源少，且反應(yīng)底物的濃度過低，不利于醋酸的生成，而乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時高滲透壓對醋酸菌的生長有抑制作用[9]，初步確定6%～8%為適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍。

2.2.4 接種量對醋酸產(chǎn)量的影響 接種量對醋酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，醋酸產(chǎn)量隨著菌種接種量的增加先呈升高趨勢，接種量為55 g/L時醋酸產(chǎn)量可達(dá)1.72 g/100 mL，之后再增加接種量，醋酸產(chǎn)量基本保持不變，接種量過小，發(fā)酵體系中的醋酸菌繁殖較慢，發(fā)酵產(chǎn)醋酸的速度慢，且易導(dǎo)致發(fā)酵液發(fā)酵不充分，當(dāng)發(fā)酵體系中的醋酸菌達(dá)到一定濃度時，在短時間內(nèi)就可將乙醇消耗完全，再增加接種量，醋酸產(chǎn)量不再升高。因此試驗初步確定35～75 g/L為適宜的接種量范圍。

2.2.5 發(fā)酵液流速對醋酸產(chǎn)量的影響 發(fā)酵液流速對醋酸產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，醋酸產(chǎn)量隨發(fā)酵液流速的加快呈上升趨勢，但總的上升幅度不大。發(fā)酵液流速低，噴淋出的液體與氧氣接觸面積有限，醋酸發(fā)酵效率低，當(dāng)發(fā)酵液流速達(dá)到一定值后，反應(yīng)體系中的溶氧量已經(jīng)滿足反應(yīng)所需的耗氧量，再加快發(fā)酵液流速，醋酸產(chǎn)量不再升高[10]。因此綜合考慮，選擇2.7～6.3 L/min為適宜的發(fā)酵液流速范圍。

2.3 正交試驗結(jié)果

以玉米芯為菌床載體、發(fā)酵時間24 h，考察發(fā)酵液流速、發(fā)酵溫度、接種量、乙醇體積分?jǐn)?shù)對醋酸產(chǎn)量的影響，正交試驗結(jié)果見表2。由表2可知，各因素對醋酸產(chǎn)量影響的主次順序為發(fā)酵液流速、發(fā)酵溫度、接種量、乙醇體積分?jǐn)?shù)。最佳工藝條件組合為A2B3C1D2。即發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵液流速2.7 L/min、接種量75 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%，此條件下醋酸產(chǎn)量為1.93 g/100 mL，高于其他試驗組合的醋酸產(chǎn)量。

3 小結(jié)與討論

比較搖床發(fā)酵、靜置發(fā)酵與循環(huán)噴淋發(fā)酵3種發(fā)酵方式，循環(huán)噴淋發(fā)酵的發(fā)酵效率高、醋酸產(chǎn)量大、發(fā)酵周期短，但在生產(chǎn)過程中應(yīng)注意嚴(yán)格控制發(fā)酵時間，以避免發(fā)酵時間過長導(dǎo)致生成的醋酸損失。在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，得到優(yōu)化的循環(huán)噴淋發(fā)酵生產(chǎn)醋酸的工藝條件為以玉米芯作菌床載體、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵液流速2.7 L/min、接種量75 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)8%，此條件下醋酸產(chǎn)量為1.93 g/100 mL。

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