摘要：針對(duì)前期篩選的自養(yǎng)硝化桿菌（Nitrobacter）菌株y3-2，以實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（qPCR）測(cè)定的菌液終濃度為指標(biāo)，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化的硝化桿菌y3-2的培養(yǎng)基中CaCO3、Na2CO3、NaNO2濃度分別為0.5、1.0、0.5 g/L。最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度28 ℃、pH 8.0、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。優(yōu)化后硝化桿菌y3-2的發(fā)酵周期由優(yōu)化前的7 d縮短至4 d，菌液終濃度達(dá)到4.31×109 CFU/mL。

關(guān)鍵詞：硝化桿菌（Nitrobacter）；培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）15-3628-04

氮素是水體污染源的主要成分之一，水體的脫氮技術(shù)已經(jīng)成為人們關(guān)注與研究的熱點(diǎn)[1]。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)脫氮工藝相比，生物脫氮具有成本低、效率高、無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)今采用最多的生物脫氮工藝為硝化—反硝化工藝，其中的硝化工藝由硝化細(xì)菌（Nitrifying bacteria）完成[2]。硝化細(xì)菌分為自養(yǎng)型硝化細(xì)菌和異養(yǎng)型硝化細(xì)菌2類(lèi)，異養(yǎng)型硝化細(xì)菌僅占很少一部分，自養(yǎng)型硝化細(xì)菌是生物脫氮過(guò)程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影響污水處理系統(tǒng)的硝化效果和生物脫氮效率[3]。硝化過(guò)程通常由氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizing Bacteria，AOB）先將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，然后由亞硝酸氧化細(xì)菌（Nitrite-oxidizing Bacteria，NOB）將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽[4]。與自養(yǎng)型AOB一樣，自養(yǎng)型NOB具有生長(zhǎng)速度慢、自然條件下數(shù)量低等特點(diǎn)，這一方面使NOB的研究較為困難，另一方面也制約了其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，研究加快NOB生長(zhǎng)速度的培養(yǎng)方法顯得尤為重要[5，6]。本研究以一株亞硝酸氧化細(xì)菌y3-2[7]為出發(fā)菌株，對(duì)其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Real-time quantitative PCR detecting system， qPCR）計(jì)數(shù)的方法對(duì)其菌液濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)，以期獲得能快速培養(yǎng)硝化桿菌y3-2的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 試驗(yàn)用菌種硝化桿菌y3-2由農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工程分室分離純化保藏，經(jīng)16 S rDNA鑒定為硝化桿菌屬（Nitrobacter）細(xì)菌。

1.1.2 優(yōu)化前培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 優(yōu)化前初始培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.12 g/L、NaH2PO4·2H2O 1.16 g/L、K2HPO4·3H2O 0.33 g/L、MnSO4·H2O 0.007 6 g/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 50 μg/L、無(wú)水NaCO3 0.5 g/L、NaNO2 1.0 g/L、pH 7.5，121 ℃、30 min滅菌。優(yōu)化前的培養(yǎng)條件為250 mL三角瓶加入50 mL培養(yǎng)基，200 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.3 試劑 亞硝酸鹽和硝酸鹽定性檢測(cè)試劑[8]：Griess試劑、鹽酸溶液、氨基磺酸銨溶液、二苯胺—硫酸試劑，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，硝化桿菌qPCR標(biāo)準(zhǔn)樣品為農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工程分室自制。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1）單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)分別考察培養(yǎng)基中CaCO3、Na2CO3和NaNO2濃度對(duì)試驗(yàn)菌株生長(zhǎng)的影響。①CaCO3濃度。Na2CO3濃度1.5 g/L，NaNO2濃度0.5 g/L，CaCO3濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L。②Na2CO3濃度。CaCO3濃度0.5 g/L，NaNO2濃度0.5 g/L，Na2CO3濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L。③NaNO2濃度。CaCO3濃度0.5 g/L，Na2CO3濃度1.5 g/L，NaNO2濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L。每個(gè)單因素試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，每天定性檢測(cè)NO2-、NO3-含量，觀察NO3-生成情況，記錄NO2-完全硝化所需時(shí)間，并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2）正交試驗(yàn)。設(shè)置三因素三水平正交試驗(yàn)考察CaCO3、Na2CO3和NaNO2濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置2次重復(fù)。

1.2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，設(shè)置單因素試驗(yàn)考察培養(yǎng)溫度、pH和轉(zhuǎn)速對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。①溫度。將種齡為48 h的新鮮菌液以5%的接種量接種到裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中（后面搖瓶試驗(yàn)接種方法一致），分別在15、20、25、28、30、35 ℃下恒溫培養(yǎng)，pH控制在7.0～7.5，轉(zhuǎn)速設(shè)為200 r/min，記錄NO2-完全硝化所需時(shí)間及菌落數(shù)；選擇適宜的溫度范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)。②pH。培養(yǎng)基pH控制為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培養(yǎng)溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)為200 r/min。記錄NO2-完全硝化所需時(shí)間及菌落數(shù)。③轉(zhuǎn)速。將活化后的菌種接種到三角瓶中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，pH 8.0，轉(zhuǎn)速分別為50、100、150、200、250 r/min，記錄NO2-完全硝化時(shí)間及最終菌落數(shù)。每個(gè)單因素試驗(yàn)設(shè)置3組平行。

1.2.3 分析方法 亞硝酸鹽定性檢測(cè)使用Griess試劑法；硝酸鹽定性檢測(cè)使用二苯胺-硫酸試劑法[8]；菌液濃度定量分析：首先提取收集菌液的基因組DNA，然后使用Real-time PCR定量計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)[9]，qPCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，含有Real Master Mix/20×SYBR solution 9 μL、FGPS872（5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′）1 μL（終濃度100 nmol/L）、FGPS1269（5′-CTAAAACTCAAAGGAATT

GA-3′）1 μL（終濃度100 nmol/L），DNA模板1 μL，超純水8 μL。Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性20 s，50 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，共循環(huán)40次；最后一步設(shè)置自動(dòng)制作溶解曲線。通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)樣品PCR結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)樣品PCR結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，計(jì)算出擴(kuò)增基因片段的拷貝數(shù)，從而推算出樣品中的菌體含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 不同CaCO3濃度對(duì)y3-2生長(zhǎng)及硝化作用的影響 近年來(lái)多項(xiàng)研究表明NOB具有附著生長(zhǎng)的特點(diǎn)，有研究者通過(guò)此特點(diǎn)對(duì)NOB進(jìn)行固定化，從而提高NOB的硝化效率[10]，本研究以CaCO3為添加物，提供y3-2生長(zhǎng)的附著位點(diǎn)，考察其對(duì)y3-2生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，CaCO3對(duì)y3-2的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，其濃度為0.5 g/L時(shí)促進(jìn)作用最佳，菌液終濃度達(dá)8.0×108 CFU/mL，而未添加CaCO3的對(duì)照組菌液濃度不足1.0×108 CFU/mL。此外，CaCO3添加濃度為0.5 g/L時(shí)，硝化速度也明顯加快，NO2-完全硝化僅需5 d，而對(duì)照組需要9 d。

2.1.2 不同Na2CO3濃度對(duì)y3-2生長(zhǎng)及硝化作用的影響 Na2CO3濃度對(duì)y3-2生長(zhǎng)和硝化作用的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，Na2CO3濃度為1.0～3.0 g/L時(shí)NOB具有良好的生長(zhǎng)勢(shì)，其中1.0 g/L試驗(yàn)組細(xì)菌生長(zhǎng)情況最好，菌液終濃度最高，且完全硝化NO2-僅需5 d；當(dāng)Na2CO3濃度小于1.0 g/L時(shí)，y3-2生長(zhǎng)速度很慢，原因是過(guò)低的碳源濃度使y3-2生長(zhǎng)不充分，生物量較低。在氮源濃度一定的情況下，碳源濃度過(guò)高致使培養(yǎng)液中碳氮比（C/N）過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氮源的代謝利用發(fā)生異常，從而細(xì)菌繁殖緩慢，因此Na2CO3濃度高于3.0 g/L時(shí)菌液中終濃度較低，NO2-完全轉(zhuǎn)化所需時(shí)間也延長(zhǎng)。

2.1.3 不同NaNO2濃度對(duì)y3-2生長(zhǎng)的影響 NO2-是NOB生長(zhǎng)與繁殖過(guò)程中唯一的氮源，它是控制NOB生長(zhǎng)的重要因素，不同NO2-濃度對(duì)y3-2生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，NaNO2濃度為0.5～4.0 g/L時(shí)對(duì)NOB生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，0.5 g/L時(shí)y3-2生長(zhǎng)速率最快，NaNO2為4.0 g/L時(shí)菌液終濃度最大，約為2.0×109 CFU/mL；但隨著NaNO2濃度進(jìn)一步升高，y3-2的生長(zhǎng)被抑制，且完全硝化NO2-的時(shí)間也逐漸延長(zhǎng)。這是因?yàn)镹O2-濃度過(guò)低使細(xì)菌缺乏充分的底物來(lái)進(jìn)行繁殖，而濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)y3-2產(chǎn)生抑制，這種抑制可能是過(guò)高濃度的NO2-的毒害作用或是一種鹽脅迫。

2.1.4 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由極差分析可知，各因素中對(duì)菌液終濃度的影響由大到小依次為CaCO3濃度、Na2CO3濃度、NaNO2濃度。最佳試驗(yàn)組合為A2B1C1，即培養(yǎng)基中含有CaCO3濃度0.5 g/L、Na2CO3濃度1.0 g/L、NaNO2濃度0.5 g/L。在此條件下進(jìn)行4次重復(fù)試驗(yàn)，得到的平均菌液終濃度為4.31×109 CFU/mL，高于所有正交試驗(yàn)組合的結(jié)果。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化的結(jié)果

2.2.1 溫度對(duì)y3-2生長(zhǎng)和硝化作用的影響 有文獻(xiàn)報(bào)道NOB在15～30 ℃具有較好的生長(zhǎng)狀態(tài)和硝化活性[11]。y3-2在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)及硝化NO2-的情況見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，菌液終濃度隨培養(yǎng)溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，28 ℃時(shí)y3-2的菌液終濃度最高，此時(shí)完全硝化0.5 g/L NaNO2所需時(shí)間為4 d。

2.2.2 pH對(duì)y3-2生長(zhǎng)和硝化作用的影響 pH不同會(huì)導(dǎo)致菌株酶活力的變化，從而使菌體生長(zhǎng)和代謝能力發(fā)生改變[12]，傳統(tǒng)研究認(rèn)為pH在6.5～8.0適宜NOB生長(zhǎng)，在pH 8.0～8.5范圍內(nèi)NOB硝化效率最高[13]。pH對(duì)y3-2生長(zhǎng)和硝化作用的影響見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，pH為8.0時(shí)菌液濃度可達(dá)1.68×109 CFU/mL，明顯高于其他處理，說(shuō)明y3-2的最適培養(yǎng)pH為8.0，此時(shí)完全硝化0.5 g/L NaNO2所需時(shí)間為4 d。

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)y3-2生長(zhǎng)和硝化作用的影響 NOB是好氧性細(xì)菌，溶氧量對(duì)其生長(zhǎng)有著重要的影響，一般而言溶氧需控制在2 mg/L以上[14]。在一定溫度下溶氧是裝液比（培養(yǎng)基裝液量/三角瓶體積）和搖瓶轉(zhuǎn)速的函數(shù)，如果裝液比固定則轉(zhuǎn)速將直接影響培養(yǎng)基中的溶氧量。y3-2在不同轉(zhuǎn)速下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖6，從圖6可以看出，菌液終濃度隨著轉(zhuǎn)速的加快先快速升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min及以上時(shí)菌液終濃度隨轉(zhuǎn)速加快而升高的趨勢(shì)變得平緩，說(shuō)明轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時(shí)溶液中的溶氧量已達(dá)到細(xì)菌最快生長(zhǎng)所需的條件，再增大轉(zhuǎn)速也無(wú)益于提高細(xì)胞濃度，反而消耗過(guò)多的能源，增大培養(yǎng)成本。

3 小結(jié)與討論

本研究針對(duì)一株硝化桿菌y3-2進(jìn)行了培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)液中的菌液終濃度達(dá)到了4.31×109 CFU/mL，并且培養(yǎng)時(shí)間從初始的7 d縮短至4 d，減少了接近一半的培養(yǎng)周期，為亞硝酸氧化細(xì)菌的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。優(yōu)化后的培養(yǎng)基中Na2CO3濃度為1.0 g/L、NaNO2濃度為0.5 g/L，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為28 ℃恒溫培養(yǎng)、pH 8.0、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。另外，本試驗(yàn)還探討了添加硝化細(xì)菌生長(zhǎng)附著物CaCO3之后對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響，并確定CaCO3濃度為0.5 g/L時(shí)最有利于y3-2的生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉晶晶，汪 蘋(píng)，王 歡. 一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的脫氮性能研究[J]. 環(huán)境科學(xué)研究，2006，21（3）：121-125.

[2] 陳梅娟.自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離、鑒定及norB基因工程菌的構(gòu)建[D].北京：北京化工大學(xué)，2010.

[3] 余敦耀，邱雁臨，朱 影. 高效硝化細(xì)菌的分離與鑒定[J]. 化學(xué)與生物工程，2008，25（4）：60-63.

[4] 鄭 平，徐向陽(yáng)，胡寶蘭. 新型生物脫氮理論與技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2004.156.

[5] 琚 姝，周長(zhǎng)林，竇 潔. 高硝化活性亞硝酸鹽氧化細(xì)菌的培養(yǎng)和應(yīng)用研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2005，32（5）：56-61.

[6] 徐 敏. 硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)、保存及應(yīng)用基礎(chǔ)研究 [D]. 山東青島：青島理工大學(xué)，2007.

[7] 吳定心. 自養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離純化[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

[8] 趙 斌，何紹江. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：科學(xué)出版社，2002. 277.

[9] 李 彬. 富營(yíng)養(yǎng)化湖泊系統(tǒng)藻類(lèi)水華與硝化細(xì)菌種群作用關(guān)系的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[10] 崔華平，林煒鐵.亞硝酸鹽氧化細(xì)菌固定化方法的優(yōu)化研究[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2（1）：1-5.

[11] 張 巍，趙 軍，郎咸明，等. 硝化細(xì)菌在不同溫度下對(duì)氮素的去除效能研究[J]. 環(huán)境科學(xué)與管理，2010，35（6）：83-86.

[12] ALLEMAN J E，KERAMIDA V，PANTEA-KISER L. Light induced Nitrosomonas inhibition[J]. Water Research，1987，21（4）：499-501.

[13] BECCARI M， PINTO A D， RAMADORI R， et al. Effects of dissolved oxygen and diffusion resistances on nitrification kinetics[J]. Water Research，1992，26（8）：1099-1104.

[14] 白秀峰.發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2003.97.